不同结构的蛋白编码基因的密码子偏性研究

利用聚类分析方法 ,对两类具有不同三级结构的75个蛋白的编码基因的密码子使用偏性进行了分析。75个基因样本序列按照对应蛋白的三级结构被很清晰的分成了两类 ,从而发现密码子的使用与蛋白质的三级结构有很大的相关性。

抗光肩星天牛苏云金芽胞杆菌Bt886菌株的分离及对毒蛋白编码基因的初步鉴定

从拟谷盗虫尸中分离到一株对鞘翅目害虫光肩星天牛幼虫毒杀作用明显的Bt菌株Bt886。幼虫死亡率高达 6 0 % ,存活者生长明显受到抑制。经过晶体形态特征和杀虫谱分析 ,初步确认该菌株属于cry3类。比较cry3类基因的保守序列 ,利用一对cry3特异引物成功地从Bt886菌株中克隆到了一段基因片段并克隆至pGEM -T载体上。测序分析发现该片段与cry3Aa1基因具有很高的同源性 ,确定来自毒蛋白编码基因。Southern杂交分析表明该基因位于该菌株的质粒上。

鲈形目线粒体DNA蛋白编码基因的适用性分析

[目的]对线粒体DNA 13种蛋白质编码基因的系统进化分析能力进行了评估。[方法]单个基因和基因拼接序列比较,综合考虑序列的信息量和邻位连接法构建系统进化树的置信度。[结果]按分类阶元不同将基因都分成不同的4等。在鲈形目的科间阶元,最好的为ND6和cox2;好的序列为ND5和ND4;ND4L、ND3和ATP8差;包括Cyt b、cox1在内的其余6种基因为中等;在属内种间阶元,最好的为ATP6和cox2;好的序列为ND2和cox1;ND6、ND3和ATP8差;包括Cyt b在内的其余6种基因为中等。另外,分析揭示序列长度的增加可以提高系统进化树的置信度,且属内物种间比较时序列长度的影响小于高级阶元。[结论]线粒体DNA蛋白质编码基因的信息分布具不均一性,需分类阶元选择最佳基因和组合。

人类蛋白编码基因局部GC水平相关性分析

GC含量是基因组DNA序列碱基组成的重要特征,蕴涵基因结构、功能和进化信息。文中通过从公共数据库提取7992个非冗余的人类蛋白质编码基因DNA序列,分析了基因序列不同区域的局部GC含量和相关性。结果表明:基因局部GC含量呈现不均一性,5′非翻译区GC水平最高,为62.56%;而3′非翻译区GC水平最低,为43.97%。3′侧翼序列的GC含量能较好地代表基因所在区域DNA长片段的GC水平。虽然开放阅读框的GC含量比内含子、3′非翻译区和3′侧翼序列的GC含量高,但4个区域的GC含量之间均存在较高的相关性。密码子第三位置的平均GC含量(GC3)为58.09%,显著高于密码子第一位置和第二位置的GC含量,且与开放阅读框的GC水平高度相关,相关系数高达0.91。GC3与内含子、3′非翻译区、3′侧翼序列的GC水平相关性也较高,GC3对3′侧翼序列的GC含量的直线回归斜率为1.25。因此,GC3可作为基因所在区域GC水平变化的敏感性指标。而密码子第一位置和第二位置以及5′侧翼序列和5′非翻译区GC水平与基因其他区域的GC水平的相关性较弱。该研究结果提示:基因蛋白编码区密码子第三位置、内含子、3′非翻译区和3′侧翼序列的碱基可能经历了相近的进化过程,而蛋白编码区密码子第一位置和第二位置、5′侧翼序列和5′非翻译区由于功能的需要而经历了不同的突变和选择。

五种啮齿类动物mtDNA蛋白编码基因序列变化的比较

目的利用本实验室测定的中国地鼠、金黄地鼠和GenBank中田鼠、小鼠、大鼠的线粒体全基因组序列,比较分析五种啮齿类动物的mtDNA蛋白编码基因序列的变异,探讨其分子进化关系。方法将五种动物各自的13个蛋白编码基因分别连接成一个序列,用DNAstar-EditSeq分析软件计算每个序列的碱基长度和组成,计算蛋白编码基因的碱基和氨基酸的差异。以人为外群,基于连接在一起的13个蛋白编码基因的氨基酸序列,用MEGA4.0软件通过最大简约性法(MP)和非加权成对平均数法(UPGMA)构建进化树。结果在五种啮齿动物的13个蛋白基因序列中,A、T、C、G碱基的平均含量为32.4%、29.6%、26.2%和11.9%,中国地鼠mtDNA各蛋白编码序列以及其编码的氨基酸序列与其他物种相比,与金黄地鼠的相应序列差异最小,与大鼠mtDNA各蛋白编码序列以及其编码的氨基酸序列差异较大。分子进化树也显示中国地鼠和金黄地鼠的亲缘关系最近,与小鼠、大鼠存在的差异相对大。结论五种动物的碱基组成的百分比中显示G的相对缺乏,相互之间的进化关系与传统的分类地位基本吻合。

幽门螺杆菌18000u外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的:构建含幽门螺杆菌(Hp)18000u外膜蛋白编码基因的重组载体并在E.coli BL21中表达。为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础。 方法:用PCR从Hp染色体中,扩增18000u外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经Bam H I,Hind Ⅲ双酶切、纯化、连接,转化含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达。表达产物经纯化后,用ELISA法检测其抗原性。 结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp 18000 u的外膜蛋白编码基因,与Tomb等报道相比较,有2％编码基因发生变异,1.7％氨基酸残基改变。经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白为38000 u,其中pET32a(+)表达的蛋白约为20000 u,可溶性表达产物占全菌总蛋白的21.3％。重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95％以上。ELISA法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性。 结论:成功地克隆并表达Hp 18000 u的外膜蛋白编码基因,为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了基础。

蛋白编码基因中四倍简并位点碱基转换与颠换的规律研究

以同源性在７０％以上的６组同源蛋白为材料，从系统发生的角度研究发生在四倍简并位点上的转换和颠换的关系。考虑碱基组成对碱基替换的影响后，转换对颠换的优势在四倍简并位点也存在，但不如线粒体ＤＮＡ中显著。比较不同转换或颠换之间的关系发现，不同转换或颠换以十分接近的比率发生，Ａ－Ｇ转换与Ｃ－Ｔ转换的比率为０．９９：１，各种颠换相对于Ｔ－Ｃ转换的比率在０．６５－０．７３之间。进一步讨论了转换对颠换存在优势的原因，推测它可能与体内存在的诱变剂有关。

SARS病毒S蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的 克隆传染性非典型肺炎 (SARS)病毒纤突蛋白S氨基端编码序列 ,并将其置于大肠杆菌作融合表达 ,为快速检测SARS病人IgM提供抗原。方法 从GenBank获得SARS病毒BJ0 1株纤突蛋白S基因序列 ,人工合成其氨基端 5 0 1bp双链DNA序列 ,在 5’和 3’端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。常规法将其克隆到 pBluescriptⅡSK(+)质粒中进行核酸序列测定 ,进一步将其克隆进原核表达载体pGEX 6 p 1中 ,构建含S蛋白基因的重组原核表达质粒。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌 (E .coli)BL2 1感受态细胞 ,以异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明 ,克隆的 5 0 1bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ0 1毒株序列呈现 10 0 %同源性。IPTG诱导后的菌体 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ,显示有一个大小为 4 2ku的融合表达蛋白产生。结论 S蛋白氨基端 5 0 1bp编码基因在E .coli中获得正确表达 ,为进一步研究提供了实验室资料。

猪蛋白编码基因3’UTR中IRPRE1元件的鉴定及其基因特征分析

为鉴定猪全基因组范围内蛋白编码基因3’UTR(3’-untranslated region)中反向重复PRE1(inverted repeated PRE1,IRPRE1)元件,对猪全基因组的22342个蛋白编码基因的3’UTR序列进行重复序列元件的生物信息学分析。结果表明:猪蛋白编码基因的3’UTR序列中短散在重复序列与简单重复序列在重复序列的类别中所占比例较高,分别为27.58%与31.08%;在SINE/t RNA的重复元件中,Pre0_SS和PRE1x元件所占的比例较高,分别为41.83%和37.51%;共有1 094个候选蛋白编码基因的3’UTR中含有IRPRE1元件;GO分析发现这些候选基因主要参与m RNA经由剪接体的剪接、细胞分裂、RNA通过酯交换反应发生的剪接、T细胞激活、RNA剪接、T细胞受体信号通路、对糖苷反应、甘油三酯稳态、外源性凋亡信号通路的正调节及胆固醇合成等生物过程;KEGG pathway分析发现这些候选基因参与了缬草碱、亮氨酸和异亮氨酸降解途径、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、吞噬体、剪接体、胆汁分泌、甲状腺激素合成和凋亡;对3个蛋白编码基因的3’UTR中的IRPRE1元件进行鉴定发现,其在多个组织中广泛表达。

人类蛋白编码基因外显子谱和同义密码子偏好的研究

从UCSC数据库提取基因序列,通过codon W软件进行密码子偏好性分析。比较分析不同外显子谱的人类蛋白编码基因密码子使用偏好,发现在多外显子基因中,随着基因外显子数增加,NNU和NNA型密码子RSCU值上升,NNC型密码子RSCU值下降,UUG密码子RSCU值增加,而其它NNG型密码子RSCU值下降。作为具有最少外显子数的基因,单外显子基因密码子RSCU值具有异常的表现,表明其具有和多外显子基因不同的起源和进化过程。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA在去除信号肽后,对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆,并测序分析,结果表明其与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamH 和Sal 内切酶识别序列的另1对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建的表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,表达的MSTN分子质量为41.4513ku。因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92.5%。

糖尿病大鼠P-糖蛋白编码基因Abcb1 mRNA的表达及其对口服恩诺沙星药动学的影响

试验旨在研究糖尿病大鼠肝脏、肾脏、空肠和回肠中P-糖蛋白编码基因Abcb1 mRNA的表达水平及其对口服恩诺沙星药动学的影响。通过链脲佐菌素(STZ)诱导建立清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠的糖尿病模型,采用实时荧光定量法检测并比较2组(健康组和糖尿病组)大鼠不同器官中Abcb1 mRNA的表达差异,采用高效液相色谱法(HPLC)进一步测定糖尿病大鼠口服恩诺沙星的血药浓度。结果表明,糖尿病大鼠肝脏和回肠中Abcb1a mRNA的表达量显著高于健康组(P<0.05),肾脏和空肠中Abcb1a mRNA的表达量虽有波动,但差异不显著(P>0.05)。健康大鼠各器官中Abcb1b mRNA的表达水平与糖尿病大鼠相比未见显著差异(P>0.05)。口服恩诺沙星的药动学结果表明,糖尿病组大鼠血液中恩诺沙星的峰浓度、0~12 h的药-时曲线下面积和表观分布容积与健康组大鼠相比,均发生显著变化(P<0.01、P<0.05、P<0.05),其他药动学参数虽有变化,但差异不显著(P>0.05)。推测,糖尿病会导致大鼠体内Abcb1a mRNA的表达量发生变化,进一步导致口服药物在大鼠体内药动学过程发生变化。

KSHV包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A和gL的克隆及真核表达

目的:克隆并在293T细胞中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A与gL。方法:以BCBL-1细胞总DNA为模板,用PCR方法扩增出K8.1和gL基因;以BCBL-1细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出K8.1A基因。将PCR产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,分别构建含K8.1、K8.1A和gL基因的重组真核表达质粒。重组质粒转染293T细胞,用Westernblot的方法检测K8.1和K8.1A在293T细胞中的表达;RT-PCR方法检测gL基因在293T细胞中的转录。结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的K8.1、K8.1A和gL基因与GenBank中已登记的KSHVK8.1、K8.1A和gL基因序列100%同源。Westernblot结果显示,在约35ku位置有目的条带,与预期的重组K8.1和K8.1A蛋白大小一致。RT-PCR结果显示约在500bp位置检测到特异性条带。结论:KSHVK8.1、K8.1A和gL编码基因在293T细胞中获得正确表达。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)基因的cDNA去除信号肽后PCR扩增出成熟蛋白编码序列1.2kb片段熏将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞;筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamHI和SalI内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了编码猪肌生成抑制素成熟蛋白的原核表达载体。LB液体培养基中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示重组菌表达的MSTN蛋白以包涵体形式存在;经薄层扫描仪扫描分析SDS-PAGE凝胶,表达的MST包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,其相对分子质量为41451.3。所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签HisTrap亲和柱纯化后纯度可达92.5%。该试验为获得较好的猪肌生成抑制素并制备抗体打下了良好的基础。

捕获输出蛋白编码基因的小分子量质粒载体的构建与验证

自行设计一对引物,从质粒pUC18上扩增一段无启动子和信号肽的β-内酰胺酶基因(△P△SPAmp),经pGEM-T-EASY载体克隆到pET-28衍生质粒pKan的EcoR 和Xba 间,得到在Kan平板中生长而在Amp和Kan双抗平板中不能生长的转化子pMBL-E质粒.经部分酶切补平自连,筛选得到消除Hind 位点端EcoR 位点的质粒,即为用于输出信号基因片段捕获的目的载体pMBL,大小为3.46kb.经酶切鉴定和测序分析,表明构建的载体与预期设计的一致,并应用四环素抗性基因(Tetr)对载体的有效性进行了验证,证明构建的载体pMBL能有效捕获含启动子和信号肽序列的输出蛋白编码基因.

Pt-mVirD2-GUS质体蛋白编码基因的合成及转化烟草的研究

将拟南芥冷调节基因AtCor15A的质体定位信号肽编码序列、丧失了核定位信号序列的根癌农杆菌VirD2基因突变序列mVirD2和GUS基因序列,拼接成pt-mVirD2-GUS嵌合基因,由CaMV35S启动子和Tons终止子控制,并经根癌农杆菌介导,成功导入了烟草基因组。

钙黏蛋白编码基因19基因突变致仅限女性的癫痫伴智力低下2例

限于女性的癫痫伴智力低下(epilepsy with mental retardation limited to females,EFMR)是一种其主要特点为婴儿期或幼儿早期发病、一般仅累及女性、发作有热敏感性的儿童期癫痫综合征,国外文献报道钙黏蛋白基因超家族亚型钙黏蛋白编码基因19(protocadherin 19,PCDH19)为其致病基因。作者对2015年中南大学湘雅医院小儿神经内科诊断的2例PCDH19新发突变所致的EFMR患者临床资料进行回顾性分析,并查阅PubMed,OMIM和HGMD等数据库,结合相关文献总结其临床特征。2例患儿均符合PCDH19突变致EFMR的典型临床表现,癫痫发作均存在热敏感性,发作时伴或不伴尖叫、发作形式多样、常伴有认知损害或自闭症样表现,血尿筛查未见明显异常,头颅磁共振成像无特征性改变,癫痫基因芯片测序分析发现PCDH19新发突变。此疾病与神经型钠离子通道α1亚单位SCN1A突变所致的Dravet综合征临床表现极为相似,因此,对于SCN1A基因突变阴性的临床表现与Dravet综合征相似的患儿,特别是女性,应考虑PCDH19所致EFMR的可能。早期进行PCDH19基因检测,不仅对于临床医师了解和分析该病预后,而且对于向家长提供遗传咨询,都具有重要意义。

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G +C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。

酵母双杂交技术筛选与克隆白细胞中与NS5ATP7蛋白结合的蛋白编码基因

目的 应用酵母双杂交体系寻找与丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A反式激活蛋白 7(humangene 5transactivatedbynonstructuralprotein 5AofhepatitisCvirus ,NS5ATP7)相互作用的白细胞蛋白 ,以探讨SN5ATP7的生物功能。方法 应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5ATP7诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合 ,于涂有X_α_gal营养缺陷型培养基 (SD/_Trp_Leu_His_Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析。结果 筛选出 15个与NS5ATP7特异性相互作用的克隆 ,其中包括人类RhoGDP分裂抑制剂α、人类细胞色素b5 5 8α亚单位、人类MLL(MLL)基因外显子、人类S10 0钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B)、人类移动抑制因子相关蛋白 14变体E(S10 0A9)、人类金属硫蛋白 2A、人类染色体序列及人类cDNA序列等 ,1个是未知功能基因。结论 初步克隆了NS5ATP7与白细胞结合蛋白基因 ,根据所克隆到的基因 ,对以后研究NS5ATP7的功能有一定的提示作用 ;