纤维状α-突触核蛋白聚集体激活NLRP3炎症小体的机制研究

目的探索纤维状α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集体激活NLRP3炎症小体诱导神经炎症的机制。方法构建纤维状α-synuclein聚集体,采用纤维状α-synuclein聚集体刺激BV-2小胶质细胞,检测白介素(IL)-1β、IL-18、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等相关炎症因子和NLRP3、caspase-1、ASC等蛋白的表达和mRNA水平评价NLRP3炎症小体激活;采用乳酸脱氢酶释放(LDH)实验检测细胞焦亡的发生。机制研究部分,检测Toll样受体(TLR)2和TLR4的激活,并分别加入TLR2和TLR4抑制剂C29和TAK-242检测对纤维状α-synuclein聚集体诱导的NLRP3炎症小体激活的影响及核转录因子-κB(NF-κB)的入核情况。结果Western blot和硫黄素T染色实验结果显示,纤维状α-synuclein聚集体成功制备。纤维状α-synuclein聚集体刺激BV-2小胶质细胞24 h后可激活NLRP3炎症小体,表现为IL-1β释放增加,相关蛋白NLRP3、caspase-1表达升高,NLRP3、ASC和IL-1β的mRNA水平显著增加,且核内NF-κB蛋白表达显著增加。LDH实验显示,纤维状α-synuclein聚集体不引起BV-2小胶质细胞焦亡。机制研究表明,纤维状α-synuclein聚集体可显著激活TLR2,但对TLR4表达无显著影响。TLR2抑制剂C29可显著抑制纤维状α-synuclein聚集体诱导的NLRP3炎症小体激活,但TLR4抑制剂TAK-242对α-synuclein聚集体诱导的NLRP3炎症小体激活无显著影响。结论纤维状α-synuclein聚集体可激活NLRP3炎症小体,其机制可能与激活TLR2有关。

蛋白酶体抑制剂协同组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导T细胞淋巴瘤凋亡及其与蛋白聚集体关系的研究

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替唑米(bortezomib)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对T淋巴瘤细胞株Jurkat和Hut78的协同诱导凋亡作用,以及两药联合对蛋白聚集体形成的影响。硼替唑米(10nmol/L)单药或硼替唑米(10nmol/L)联合SAHA(2μmol/L)处理Jurkat和Hut78细胞,应用台盼蓝拒染法计数细胞生长抑制率;细胞涂片观察细胞形态学改变;流式细胞术检测细胞凋亡变化;透射电子显微镜观察细胞凋亡和聚集体形成的超微结构特征。研究结果表明,与对照组和单用硼替唑米组比较,两药合用能够显著抑制Jurkat和Hut78细胞生长,促进细胞凋亡。流式结果显示,两药合用组的Jurkat和Hub78细胞凋亡细胞比例分别为(41.8±4.7)%和(72.7±11.7)%,显著高于对照组[(3.6±1.3)%和(7.0±1.9)%]和单用硼替唑米组[(6.3±2.3)%和(18.7±9.2)%](p均<0.01)。超微结构显示,单用硼替唑米组细胞内多为典型的聚集体结构,两药合用组细胞内聚集体密度降低,数量减少甚至消失,且凋亡细胞明显增多。结论:蛋白酶体抑制剂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂能有效诱导T淋巴瘤细胞凋亡,两药具有协同作用。硼替唑米促进聚集体形成,SAHA能破坏聚集体结构,是增强硼替唑米促凋亡效应的可能机制之一。

人巨细胞病毒pUL76蛋白非保守C端与蛋白聚集体形成的研究

目的通过分别构建人巨细胞病毒(HCMV)UL76基因编码蛋白的全长以及保守N端和非保守C端的真核表达质粒,探讨p UL76引起核内蛋白聚集体形成的决定序列。方法根据Gen Bank中HCMV AD169(FJ527563.1)株基因序列设计分别用于扩增p UL76全长以及保守N端和非保守C端的引物,将3段序列分别构建至增强型绿色荧光蛋白表达载体(p EGFP-N1)中,经双酶切和测序验证重组质粒的正确构建。空载体和3种重组质粒分别瞬时转染人胚肺成纤维细胞(HELF)和人肝癌细胞(Hep G-2),经逆转录(RTPCR)和Western blot法验证各段基因的正确表达,在荧光显微镜下观察转染不同重组质粒后细胞核内蛋白聚集体形成的状态。结果 p EGFP-N1空载体和p UL76保守N端均不能引起核内蛋白聚集体的形成,而p UL76及其非保守C端均能够引起核内蛋白聚集体的形成。结论 p UL76非保守C端是其引起核内蛋白聚集体形成所必须的。

牛血清白蛋白聚集体的分解动力学

以牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白,通过浊度法研究BSA形成的无序蛋白聚集体的分解动力学并揭示其复杂结构细节.实验发现,BSA无序聚集体在碱性条件下分解过程有4个动力学阶段,包括1个快速的分解阶段,2个相对较慢的分解阶段和1个动力学惰性阶段.由此推测BSA聚集体中至少含有4种不同的BSA单体形态.

蛋白聚集体在神经退行性疾病中的研究进展

错误折叠蛋白被认为是许多神经退行性疾病发病机制中的始动因素,易形成蛋白聚集物,干扰细胞正常的生理功能。因此,错误折叠蛋白及其聚集物的降解对于细胞的生存至关重要。目前,在蛋白降解通路中,除了已知的泛素-蛋白酶体系统这一重要通路外,蛋白聚集体通路也越来越受到研究者的重视。现就近年来蛋白聚集体在神经退行性疾病发病机制中的研究进展予以综述。

酸性热致大豆分离蛋白聚集体制备高冻融稳定性类蛋黄酱乳液

本文对酸性(pH 3.0)热致大豆分离蛋白聚集体(AHSPI)的平均粒径(Dh)、表面电位(ζ)、表面疏水性(H0)与溶解度进行了表征与测定,并用酸性(pH 3.0)天然大豆分离蛋白(ANSPI)、中性(pH 7.0)热致大豆分离蛋白聚集体(HSPI)作为对比分析,同时选用了AHSPI代替蛋黄制备高冻融稳定性的类蛋黄酱乳液,探讨了不同蛋白浓度对类蛋黄酱乳液的外观质地、微观结构、流变性质、DSC特性的影响。结果表明:AHSPI的平均粒径(204.67 nm)及H0(79418)均大于ANSPI与HSPI(pH 7.0),但ζ电位绝对值(35.93 mV)小于ANSPI与HSPI(pH 7.0),溶解度(89.47%)较HSPI(pH 7.0)更好。用AHSPI制备的类蛋黄酱乳液经过3次冻融循环保持稳定的最低浓度可达0.3 wt%,冻融前后乳液结构保持不变,只是乳液粒径的略微增大,流变性质表明类蛋黄酱乳液具有以弹性为主的凝胶网络结构,随着蛋白浓度的增大,油滴粒径逐渐减小,粘弹特性增强。DSC热分析表明:随着蛋白浓度的增加,类蛋黄酱乳液的结晶凝固点降低(-18→-28℃),而蛋黄酱即使具有低于冷冻温度(-20℃)的结晶凝固点(-27.89℃),仍发生了冻融破乳现象,类蛋黄酱乳液较好的界面稳定性赋予了其较好的冻融稳定性,为开发一类天然低胆固醇高冻融稳定性的酱类乳液提供了研究基础。

利用示踪粒子及膨胀流变学研究β-乳球蛋白聚集体的界面行为

在热加工过程中,蛋白易形成聚集体,不同聚集形态蛋白质的界面结构、流变学特性对乳液体系的稳定性及油脂消化特性具有显著影响。为探究β-乳球蛋白聚集体的界面行为,本研究通过调节pH值和加热时间制备了β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)的不同聚集体,包括β-lg、纳米颗粒聚集体(β-lg NP)和纤维状聚集体(β-lg F),并对这3种形态蛋白质的形貌进行了表征;利用示踪粒子微流变学及膨胀流变学对不同质量分数的β-lg、β-lg NP、β-lg F在油-水(癸烷-水)界面的吸附过程及胆盐取代行为进行研究,并通过体外消化模型实验研究了3种形态蛋白质乳液的消化特性。结果表明,质量分数越高,蛋白向界面扩散越快,形成界面黏弹性越强;蛋白质聚集体比β-lg向界面吸附更快,且形成界面膜弹性更高;在胆盐取代界面蛋白过程中,发现β-lg NP抵抗胆盐取代能力最强,β-lg最弱,与乳液的体外消化模型实验结果一致。

自噬的抑制和糖原合成酶激酶-3β的激活促进tau蛋白聚集体形成

神经纤维缠结（NFT）是阿尔茨海默病的特征性病理标志。据报道糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）在tau蛋白形成NFT中起着重要作用,而自噬障碍可能有助于tau蛋白聚集体形成。最近,韩美科学家报道了他们针对GSK-3β介导的tau蛋白磷酸化在自噬降解中的作用的研究。他们分别将T4（野生型tau蛋白）、T4C3（由caspase-3在Asp421位点对tau蛋白切割成的片段）和T4-2EC（在Ser396/Ser404位点低磷酸化的tau蛋白）转染至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,

靶向脑内异常蛋白聚集体的PET显像剂研究进展

大多数神经退行性疾病被证实与脑内特定蛋白质的错误折叠与异常聚集有关,如β-淀粉样蛋白斑块和Tau蛋白的异常聚集是阿尔茨海默病的两个重要病理学特征,α-突触核蛋白聚集体是帕金森病和路易体痴呆的生物学标志物,突变亨廷顿蛋白是亨廷顿舞蹈症的生物学标志物。在过去的几十年里,随着正电子发射断层扫描(PET)技术和放射性诊断药物的发展,PET显像被越来越多地应用于中枢神经系统疾病的早期诊断和相关治疗药物的疗效评估。综述了靶向于上述4种蛋白聚集体的PET显像剂的研究进展,为相关PET显像剂的进一步结构优化与临床应用提供思路与参考。

硫磺素T微孔板检测法筛选β-折叠蛋白聚集体亲和配体

目的采用硫磺素T微孔板检测法筛选亲和β-折叠蛋白聚集体的配体。方法将硫磺素T、β-折叠蛋白聚集体、配体混合后,置室温下孵育。在酶标仪96孔板内测定荧光强度,激发和发射波长分别为440、480 nm。计算实验组与对照组荧光强度的比率(I),筛选亲和配体。结果完成60个配体的检测。其中,有38个配体对Tau聚集体的I值小于1,有12个配体对Aβ_(1-42)聚集体的值小于1。结论硫磺素T微孔板检测法简便快捷,为相关蛋白聚集体亲和配体的初步筛选提供了有效工具。

聚集体自噬研究进展

错误折叠蛋白在细胞内大量堆积后会形成蛋白聚集体,干扰细胞正常生理活动,以至引发各种人类疾病,尤其是神经退行性疾病。因此,研究聚集体的形成和清除过程对治疗神经退行性疾病具有重要意义。蛋白聚集体在形成过程中会受到相分离的调控,在液相、固相等多种状态间转变,这影响了聚集体的性质及其清除方式。尽管细胞内多种蛋白质量监测系统均可参与错误折叠蛋白的清除,但是一旦聚集体形成,通常需要通过自噬途径清除,即聚集体自噬过程。在聚集体自噬中,p62、NBR1、TAX1BP1、Tollip、CCT2等自噬受体能够帮助自噬系统识别蛋白聚集体,在聚集体的清除中发挥重要作用。文章主要介绍聚集体的形成以及通过自噬清除的过程,并聚焦于聚集体自噬领域的最新研究进展。

贮藏过程中米谷蛋白纤维聚集体理化性质变化规律

目的:探究贮藏时间与不同加热时间下米谷蛋白纤维聚集体(Rice glutelin fibril aggregates,RGFAs)溶液功能特性之间的关系。方法:以米谷蛋白(Rice glutelin,RG)为原料,在85℃、pH 2.0的条件下加热2~15h制备得到RGFAs,在4℃下分别贮藏1d和4d,测定不同RGFAs样品的表面疏水性、乳化性、剪切黏度、RGFAs-淀粉混合物糊化特性及水解率。结果:在低温贮藏4d后,乳化性得到明显改善;热处理2~10h形成的RGFAs溶液的表面疏水性显著降低(P<0.05),而15h热处理后形成的RGFAs溶液表面疏水性无显著变化(P>0.05),同时15h-RGFAs溶液体系的剪切黏度降低。贮藏1d的2h-RGFAs与淀粉混合物的糊化温度最低(83.98±0.08)℃,且贮藏1d的RGFAs样品与小麦淀粉混合物的水解率更低。结论:贮藏1d的RGFAs样品对小麦淀粉的水解抑制作用优于贮藏4d的RGFAs样品。

大豆蛋白肽聚集体与EGCG复合纳米颗粒及其乳液特性

通过超声处理成功构建大豆蛋白肽聚集体(soybean peptide aggregates,SPA)与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG)复合制备纳米颗粒。以粒径、Zeta电位、荧光光谱、X射线衍射、乳化稳定性和氧化稳定性为指标,对纳米颗粒及其乳液进行研究。结果表明,超声和EGCG在减小颗粒粒径方面具有协同作用。当EGCG添加量为0.80%(m/m)时,纳米颗粒粒径最小,Zeta电位绝对值最大。添加EGCG的复合纳米颗粒由晶态向非晶态转变,且荧光强度随EGCG添加量的增加发生依赖性猝灭。与SPA相比,添加EGCG复合纳米颗粒制备乳液的乳化活性和乳化稳定性及氧化稳定性均有所提高。

体积排阻色谱在蛋白质药物聚集体领域的应用

蛋白质聚集现象是生物制药行业面临的重大问题之一,对蛋白质药物有效性、安全性、质量可控性有很大影响。体积排阻色谱技术是蛋白质药物及其聚集体检测分析的标准技术,具有操作简单、分离条件温和、基本不破坏蛋白质药物结构等优点。但由于蛋白质与固定相存在非特异性相互作用,采用该法检测时存在洗脱延迟、色谱峰拖尾、基线漂移、蛋白质回收率低等问题。该文介绍了体积排阻色谱的分离原理及实际应用,并对该技术在蛋白质药物检测中存在的非特异性吸附问题及相关方法优化做了简要概述。同时列举了几种与体积排阻色谱互补的可用于蛋白质药物聚集体分析的技术。最后,对体积排阻色谱技术的发展前景进行了展望。

细胞外基质蛋白调控多发性硬化症髓鞘再生的研究进展

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)形成神经细胞生长的微环境,其重塑对脱髓鞘的损伤组织髓鞘再生有重要意义。多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种免疫系统介导的慢性中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病,主要病理特征为脱髓鞘和髓鞘再生失败。MS病灶中形成大量纤粘连蛋白聚集体(fibronectin aggregates,aFn)会抑制髓鞘再生;基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、腱生蛋白C(tenascin C,Tn-C)、透明质酸(hyaluronan,Ha)、硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)等细胞外基质蛋白均可参与调控髓鞘再生。

肌萎缩侧索硬化症发病机制及药物研究进展

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种病因未明的运动神经元疾病,同时累及上、下运动神经元,患者表现出进行性加重的肌肉萎缩、无力、瘫痪,最终死于呼吸衰竭。ALS具有进展快、致死率高的特点,该疾病异质性强,发病机制研究不明确,缺乏有效的治疗药物。因此,探究ALS疾病病理机制、助力新药研发,解决未被满足的临床需求具有重大的科学价值及社会意义。该文针对ALS的发病机制及治疗药物的研究现状进行综述,希望为ALS药物研发提供思路。

不同离子强度大豆分离蛋白热诱导聚集体的研究

目的:研究离子强度对大豆分离蛋白热诱导聚集的影响。方法:采用可见分光光度计,在波长600 nm处测定不同离子强度下的大豆分离蛋白热处理溶液的吸光值,并将其作为溶液的浊度;采用体积排阻色谱(SEC-HPLC)、动态激光光散射(DLS)及zeta电位仪研究不同离子强度下大豆分离蛋白热诱导聚集体的分子质量分布、粒径分布及zeta电位。结果:随着离子强度的增加,大豆分离蛋白聚集体溶液的浊度增加,体系的聚集体部分及平均流体动力学半径(Rh)大幅增加,zeta电位逐渐降低。结论:电荷屏蔽作用使分子间斥力降低,促进了高离子强度下聚集的产生。

大豆蛋白/葡聚糖混合体系相行为及流变性质的研究

研究了室温下,pH 7.0时不同尺寸大小的大豆蛋白热聚集体和不同分子质量的葡聚糖混合体系的相分离行为,并以天然大豆蛋白和葡聚糖混合体系作为对照体系。通过离心、化学分析和目测建立了相图,结果表明两种大分子的相分离是由于葡聚糖分子链的排空相互作用,使得蛋白质富集部分间产生了交联;蛋白质聚集体的尺寸和葡聚糖的分子质量大小同时影响了混合体系的相行为,随着蛋白质粒子增大或多糖分子质量增加,相边界发生了位移,混合体系的均相区域变窄,凝胶区域增大。流变研究进一步证明蛋白质聚集体的尺寸和葡聚糖的分子质量大小同时影响了相分离体系的微观结构。

各国对注射液不溶性微粒的监管要求及在生物技术药物的应用思考

目的:通过对比《中华人民共和国药典》2020年版(ChP 2020)、2023年美国药典(USP-NF2023)、欧洲药典11.0版(EP 11.0)、日本药典18版(JP 18)中注射剂不溶性微粒检测方法相关内容,分析不同药典对不溶性微粒的监管要求,供业界参考。以治疗性蛋白注射液为代表,结合目前各监管机构对注射液中不溶性微粒的要求,指出现有要求未能对此类生物技术药物中具有免疫原性潜力的小粒径(0.1~10μm)蛋白聚集体微粒进行控制,并从三方面提出建议以加强此类药物的质量控制,更好地保障患者的用药安全。方法:通过对比ChP 2020、USP-NF 2023、EP 11.0、JP 18中注射剂不溶性微粒检测的章节内容,对检测方法、限定标准和系统适用性检测等内容进行分析总结。通过收集归纳中、美、日、欧关于生物技术药物中不溶性微粒的药典要求和相关技术指导原则,明确目前不同机构对于生物技术药物中不溶性微粒的监管要求。结果与结论:(1)对于注射液中不溶性微粒检查方法,不同药典收载的方法均为光阻法和显微计数法,但是对各方法的适用条件的限定不同。此外,USP-NF 2023、EP 11.0和JP 18中提出的检测方法一致,Chp 2020主要在25 mL以下规格的供试品检测方面与其他三部药典有较大差异;在系统适用性检测方面,USP-NF 2023更为全面,Chp 2020在此方面要求较少;在微粒计数和限定标准方面,各药典一致;(2)对于生物技术药物,除Chp 2020外,其他药典均收载了生物技术药物不溶性微粒的检测方法,但是并未对0.1~10μm小粒径微粒进行计数和控制,仍然无法控制小粒径蛋白聚集体可能带来的免疫原性的危害;也未见各机构明确对生物技术药物中有免疫原风险的小粒径不溶性微粒的监管要求和标准。为此笔者分别在方法学研究方面、数据收集方面、研发技术要求方面提出三点建议,以更好地保障患者的用药安全。

不同粒径米糠对面团特性及饼干品质的影响

富含营养的米糠添加到饼干中成为营养饼干开发的重要方向。为评价不同粒径米糠对面团特性及饼干品质的影响,该研究制备了4种不同粒径(50、100、150、200目)米糠原料,探究了其对面粉粉质特性、面团流变特性、饼干质构特性和感官品质影响,并从面筋蛋白巯基含量、谷蛋白大分子聚合物(Glutenin Macropolymer,GMP)含量和面团微观结构变化等角度初步分析了其影响机制。结果表明,随着米糠粒径的减小,面团的稳定时间、形成时间降低,粘弹性模量增大;减小米糠粒径后可提高饼干质构特性,表现为硬度和咀嚼性降低;200目米糠饼干的模糊数学感官评分最高,达77.02分。添加米糠后,面筋蛋白巯基含量随米糠粒径减小而逐渐增大,GMP含量则逐渐降低,面筋网络结构逐渐弱化,表明降低米糠粒径促进了面筋蛋白二硫键的断裂,GMP的解聚,以及面筋网络强度的降低,从而改善了米糠饼干品质。研究结果为推动米糠在饼干等焙烤食品中的应用提供了理论指导。