志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak的表达纯化与多克隆抗体的制备及应用

目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak;pET24a(+)-Dnak原核表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经镍柱纯化Dnak蛋白。以纯化后的重组蛋白为免疫原免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测效价,Western Blot法检测灵敏度和特异性。利用制备的多克隆抗体在GST Pull-down实验中检测Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2的相互作用。真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak转染至HEK293T细胞,以制备的DnaK多克隆抗体为一抗,Western blot法检测Dnak在细胞中的表达。利用MEGA11及Genedoc软件分析此志贺氏杆菌与志贺菌属其他细菌Dnak氨基酸序列同源性。结果重组质粒pET24a(+)-Dnak与PCDNA3.1-Dnak经测序比对包含与此志贺氏杆菌(Shigella:PRJNA804371)序列一致的基因,证明质粒构建成功。诱导表达的重组Dnak蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约为75 kDa,浓度可达0.62 mg/mL;Dnak鼠多克隆抗体可与重组Dnak蛋白发生特异性反应,效价为1∶32000,至少可以在1∶6000稀释度下检测到Dnak蛋白。GST Pull-down实验可以检测到Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2发生相互作用。转染PCDNA3.1-Dnak重组质粒的HEK293T细胞可以表达Dnak蛋白。经MEGA11和Genedoc软件比对PRJNA804371株与宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)Dnak氨基酸序列同源性较高。结论成功表达志贺氏杆菌Dnak蛋白,具有良好反应性与免疫原性;制备的鼠多克隆抗体效价及灵敏度较高可满足后续实验需要。

热纤梭菌Cthe_2401蛋白功能预测及在大肠杆菌中的克隆表达与纯化

目的利用生信手段预测Cthe_2401蛋白的特性与功能,并在大肠杆菌中进行体外克隆、表达与纯化。方法利用国家生物技术信息中心数据库(NCBI)、蛋白保守结构域数据库(CDD)分析Cthe_2401蛋白的序列和进化特征,采用SWISS-MODEL在线软件进行同源建模并预测该蛋白的结构与功能;利用聚合酶链式反应(PCR)扩增Cthe_2401基因,并与pET28a载体链接构建pET28a-Cthe_2401表达质粒,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导Cthe_2401蛋白表达;利用50%硫酸铵沉淀、Ni-NTA柱以及SephadexG75葡聚糖凝胶柱纯化Cthe_2401蛋白。结果生物信息学预测表明,Cthe_2401蛋白属于Veg蛋白家族,可能与生物膜的发生和孢子形成有关;Cthe_2401蛋白成功在大肠杆菌克隆与表达,体外纯化获得约10 ku大小的蛋白条带,与预期结果一致。结论成功预测Cthe_2401蛋白的功能,成功获得Cthe_2401蛋白在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化。

SARS-CoV-2主蛋白酶的表达、纯化和一种新型晶体结构的研究

新型冠状病毒SARS-CoV-2的主蛋白酶(Main Protease, Mpro),也称为3-糜蛋白酶样蛋白酶(3CLpro),在病毒复制的过程中发挥核心作用。Mpro的结构和功能在β-冠状病毒中相对保守,在人体内没有同源蛋白,因此是抗病毒药物开发的关键靶点。本研究完成了SARS-CoV-2 Mpro的原核表达与纯化,获得具有高纯度和高均一性的蛋白质样品。利用气相扩散坐滴法开展了Mpro的结晶筛选,获得单晶体后将其浸泡在由谷胱甘肽包裹的金团簇纳米材料溶液中,成功解析了仅有第156位半胱氨酸结合一个金离子的一个新型X射线衍射晶体结构。结构分析发现,Mpro蛋白的Cys156结合金离子后Asp153~Cys156区域的构象发生了~0.6 Å的偏移,推测该构象变化进一步通过变构效应抑制Mpro的生物功能,为新冠病毒的纳米型抑制剂的研发提供了新的信息。

Hv古细菌SRP19基因的克隆、表达、重组蛋白的纯化及生物学活性的研究

目的:构建Hv古细菌SRP19蛋白的表达载体pET23d-Hv SRP19并在大肠杆菌中表达后进行纯化和研究其生物学活性,为研究SRP循环的分子机制奠定基础。方法:用体外合成的重组DNA技术,先合成具有重叠碱基的10个寡核苷酸短序列,通过拼接,获得Hv SRP19基因全长DNA后,克隆到pET23d载体上。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的大量表达产物经Q-Sepharose离子交换层析柱纯化后再用蔗糖密度梯度超速离心法分析其生物学活性。结果:正确构建了pET23d-Hv SRP19表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中获得良好的表达;成功地纯化了表达产物,纯度达95%;证明了具有SRP19蛋白的生物学活性,能够与Hv SRP RNA相互作用形成SRP19-SRP RNA的复合物。结论:纯化的Hv SRP19蛋白与Hv SRP RNA相互作用所形成的复合物,被认为是启动SRP颗粒形成和功能发挥的开始。

OjCHS原核表达载体的构建及重组蛋白的纯化

查尔酮合酶(chalconesynthase,CHS)是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,也是限速酶,它直接影响并限制类黄酮的合成与积累。在克隆得到日本蛇根草CHS基因(Oj CHS)基础上,将该基因插入原核表达载体pET-28a,完成重组表达质粒pET28a-CHS的构建。随后,利用冻融法将上述质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中用于重组蛋白的表达。选择不同IPTG浓度、诱导温度及诱导时间对重组菌进行诱导,确定了可溶性重组蛋白的最佳诱导表达条件。最后,通过洗脱、纯化、透析与浓缩完成重组蛋白的纯化。结果显示,成功构建原核表达载体pET28a-CHS,可溶性重组蛋白最佳诱导条件为:IPTG浓度0.45 mmol·L-1,25℃下诱导12 h。最后大量制备并纯化获得符合预期大小的可溶性蛋白,为深入研究Oj CHS的生物学功能奠定了基础。

鱼腥藻PCC 7120中all3556蛋白的表达与纯化

琥珀酸半醛脱氢酶在生物体中发挥重要的生理功能。通过BLAST序列分析,发现鱼腥藻PCC 7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。实验通过常规PCR从鱼腥藻PCC 7120基因组中克隆了all3556基因,将该基因构建到p ET-28a载体上并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中表达。经过SDS-PAGE电泳,结果表明:all3556蛋白可以在该表达体系中高效可溶性表达。利用镍亲和层析纯化方法得到了纯度大于95%的all3556蛋白,蛋白收率约为27 mg/g菌体。研究为进一步阐明all3556蛋白的催化功能及机制奠定了重要基础。

人源性exCAR蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

目的在大肠杆菌中表达人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区蛋白(exCAR),纯化表达蛋白并进行Western-blot-ting鉴定。方法从Hela细胞株中扩增exCAR基因片段,连接至表达质粒pET-28a(+)构建为重组质粒pET-28a-exCAR,转化至大肠杆菌BL21株中,筛选高表达株,诱导表达,利用Ni+株亲和纯化表达蛋白,SDS-PAGE后,转印PVDF膜后,进行Western-blotting鉴定。结果获得纯化的大肠杆菌表达蛋白exCAR,表达形式为包涵体,经Western-blotting鉴定为人源性exCAR蛋白。结论本研究获得了纯化的exCAR表达蛋白,为下一步的蛋白复性和腺病毒感染的阻断实验提供了基础。

水稻锌指蛋白OsRZ3基因克隆及融合蛋白的原核表达、纯化

根据NCBI登录的水稻锌指蛋白基因(NO.AK062094,OsRZ3 gene)设计特异引物,通过RT-PCR克隆该基因cDNA全长序列,核苷酸测序并比对氨基酸同源性表明具有C2HC-锌指结构域、分析预测蛋白质分子量为34kD和等电点为9.05;拟南芥原生质体亚细胞定位检测表明其在细胞核。构建pGEX6P-3::OsRZ3融合载体,电转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经1 mmol·L-1IPTG小量诱导表达,SDS-pAGEX蛋白电泳表明60 kD融合蛋白4 h最大;在LB液体培养中0.5 mmol·L-1IPTG过夜大量诱导表达,通过GST吸附柱层析获得大量包涵体纯化蛋白,1L菌液可诱导纯化到浓度1.58 mg·mL-1包涵体融合蛋白。所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达pGEX6P-3::OsRZ3融合蛋白,0.5 mmol·L-1IPTG大量诱导,通过GST柱吸附获得包涵体纯化蛋白,为作进一步的抗体制备和染色质免疫共沉淀等DNA结合的特性研究准备了基础。

SpCas9蛋白的高效可溶表达及应用

规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)主要元件Cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达,但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白,内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题。为实现化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白(SpCas9)在大肠杆菌中的高效可溶表达,进一步促进其应用及编辑技术的推广,本研究应用GB1促溶标签提高Cas9蛋白表达量及溶解度,同时通过使用多重启动子策略进一步提高了Cas9蛋白表达量。两种策略的组合使Cas9蛋白表达量提升了2.52倍。体外酶切分析显示融合GB1标签的Cas9蛋白功能活性不受影响。进一步组装RNP复合物转化黑曲霉宿主成功破坏了pyrG基因。

碱茅PutSnRK2基因表达、克隆及其蛋白纯化

从NaHCO_3逆境胁迫下碱茅(Puccinellia tenuiflora)的cDNA文库中克隆得到PutSnRK2基因全长cDNA。PutSnRK2基因序列中存在1 077bp的开放阅读框,编码358个氨基酸,预测蛋白分子量为41.11kDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR分析表明,在NaHCO_3、NaCl、ABA和PEG胁迫下,PutSnRK2基因在碱茅叶、根中均受到显著诱导(P<0.05)。同时用pGEX-6p-3载体构建了PutSnRK2基因的原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达纯化得到GST-PutSnRK2融合蛋白,为后续试验分析PutSnRK2蛋白的激酶活性、验证蛋白间的相互作用等研究奠定了基础。

大劣按蚊卵黄蛋白原基因cDNA全长序列扩增及功能域蛋白的表达与纯化研究

目的对大劣按蚊卵黄蛋白原(Anopheles dirus vitellogenin, AdVg)基因cDNA的全长序列进行扩增和分析,并对其功能域蛋白进行表达与纯化。方法基于前期克隆的AdVg基因cDNA片段,利用RACE PCR技术,扩增AdVg基因的5′末端及3′末端序列。用Vector NTI软件将测序得到的AdVg cDNA片段、5′末端序列、3′末端序列进行校正,拼接得到完整的AdVg cDNA全长序列。对AdVg全长序列进行功能域预测。利用pet28a(+)构建重组质粒进行AdVg功能域蛋白的表达与纯化。结果成功获得AdVg基因全长cDNA序列,包括117 bp的5′UTR序列、192 bp的3′UTR序列和6 186 bp的ORF序列。AdVg蛋白主要包含Vit N、DUF1943及vWD 3个结构域。通过构建重组质粒,成功表达和纯化了AdVg Vit N功能域蛋白。结论成功克隆了大劣按蚊卵黄蛋白原基因的全长序列,并获得了重组蛋白。

埃兹蛋白(Ezrin)及其突变体的原核表达与纯化

Thr567位点磷酸化是ezrin活化的必需条件。利用定点突变引物将T567突变为A或D,通过PCR扩增出相应的基因片段,将其通过T4连接酶连接至含His标签的原核表达载体pET-20b(+),构建了原核重组质粒pET-20b(+)-Ez WT,pET-20b(+)-EzT567A和pET-20b(+)-EzT567D。转化表达宿主大肠杆菌Rosseta后,用异丙基-β-硫代半乳糖诱导重组蛋白的表达。重组蛋白经亲和镍柱纯化以后,应用western blot鉴定纯化的融合蛋白。Ezrin野生型及其组成型激活和显性负突变质粒的成功构建及其目的蛋白His-Ez WT,His-EzT576A和His-EzT576D的成功表达纯化,为更深入地研究ezrin生物学功能奠定基础。

基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,并表达与纯化融合蛋白,制备其多克隆抗体。方法:通过PCR扩增Myo5a末端一个基因小片段,Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到原核载体pGEX-4T-3,制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a。鉴定后,在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化,重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定。采用融合蛋白免疫家兔,制备其抗血清,测定抗血清效价和特异性。结果:经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功,表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD。免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000,免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性。结论:实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,融合蛋白具备了较高的免疫反应性,并得到了其多克隆抗体,为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫。

Cas9蛋白的克隆表达、分离纯化及多克隆抗体制备

目的:获得高纯度Cas9蛋白,制备Cas9蛋白特异性抗体。方法:以Cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得Cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-Cas9重组表达载体;转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达Cas9蛋白,并利用His-Tag技术分离纯化Cas9蛋白;将纯化获得的Cas9蛋白免疫新西兰大白兔,制备Cas9蛋白多克隆抗体。结果:pET28a-Cas9重组表达载体转化的E.coliBL21(DE3)可表达Cas9蛋白,纯化的Cas9蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体效价>1∶256 K。结论:本研究获得了高质量Cas9蛋白及多克隆抗体,为后续CRISPR-Cas9基因编辑的应用奠定了良好的基础。

单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性

硫化物是1种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶(SQR)是硫化物代谢的关键酶。单环刺螠是1种生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物。本研究为了获得具有活性的单环刺螠SQR,将其基因的开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的表达,后采用稀释复性的方法对重组蛋白进行复性。经IPTG诱导后该重组蛋白主要以包涵体形式存在。用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白。首次通过蛋白复性的方法获得具有活性的单环刺螠SQR,确定最佳稀释复性条件为pH=8.0,蛋白浓度20μg/mL,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽=10∶1,复性时间为96 h。

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的:在大肠杆菌中表达人源转录因子sp1蛋白,并进行体外纯化。方法:首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1(88-786aa),通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果:融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论:本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。

根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解代谢中agnH基因的克隆表达与纯化

对从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离筛选得到的尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnH基因进行克隆表达,并对AgnH蛋白的表达和纯化条件进行优化,为解析agnH基因的功能和揭示根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解的分子机制提供理论依据。通过PCR扩增获得agnH全长基因(585bp),构建重组质粒pET28a(+)-agnH,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,研究不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对重组质粒pET28a(+)-agnH诱导表达的影响,用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱重组蛋白,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。结果表明:在IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导温度为25℃且诱导时间为25h条件下,AgnH蛋白表达量较高;在250mmol/L的咪唑洗脱液洗脱下,得到浓度较高的AgnH蛋白。

日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。

Smarcad1重组蛋白表达及多克隆抗体验证

目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程,选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备,并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板,构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白,并纯化。利用蛋白质免疫印迹,蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示,成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中,考马斯亮蓝染色检测,相较于诱导前,加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达,且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明,制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示,相较于对照组,制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性,结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒,利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白,利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白,为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。

人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达与配体结合活性的鉴定

血管内皮生长因子受体(VEGFR)是血管内皮生长因子的特异性受体,VEGFR-2在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用。在大肠杆菌中实现可溶性的人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达,并鉴定其与配体结合的活性。采用重叠PCR的方法合成人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区基因,将该基因与高效表达载体pET-32a重组,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,表达产物依次经过CM阳离子交换树脂和镍柱亲和层析纯化。利用ELISA法和体外抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞增殖实验检测表达产物与配体结合的活性。SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以可溶性Trx-KDR3融合蛋白表达于胞质,30oC时1 mmol/L IPTG诱导细菌5 h融合蛋白表达量约占胞质可溶性总蛋白的20%,经CM阳离子交换树脂和镍柱亲合层析纯化得到纯度为95%的产物,Western blotting鉴定是目的蛋白。ELISA和体外HUVEC细胞增殖实验显示,表达产物具有特异性结合hVEGF165的活性,且该作用呈一定的浓度依赖性。具有配体特异性结合活性的可溶性人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区成功表达,为靶向血管抗肿瘤治疗和相关抗体的研究奠定了基础。