HCA518的蛋白表达、纯化和单克隆抗体的制备

目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克隆抗体细胞株的筛选;Westem blot方法鉴定单克隆抗体的特异性;免疫荧光法对HCA518蛋白进行定位。结果:成功表达和纯化了HCA518重组蛋白,其纯度达98％。共筛选出2株分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了HCA518的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体的效价分别为1×10-4、5×10-4,属于IgG2b亚型和IgM,该抗体能与重组蛋白和肿瘤细胞核蛋白(P100)发生特异性反应,免疫荧光显示HCA518蛋白主要定位于细胞核中。结论:建立了稳定分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体特异性好,对进一步应用于检测肿瘤组织中HCA518蛋白和判断肿瘤细胞的恶性增生程度预测肿瘤预后具有重要的实用价值。

鸡补体受体2基因克隆、蛋白表达纯化及其多克隆抗体的制备和鉴定

为初步鉴定鸡补体受体2(ChCR2)基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR 2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM,将两个原核质粒转入大肠杆菌表达系统中表达GST-ChCR2-△TM和His-ChCR2-△TM蛋白。将纯化后的GST-ChCR2-△TM蛋白免疫BALB/c小鼠制备血清多克隆抗体,以His-ChCR2-△TM蛋白为包被原,ELISA检测血清多克隆抗体效价。利用间接免疫荧光试验和Western blotting对抗原抗体的特异结合性进行鉴定。结果显示,扩增到了一条大小为1113 bp的ChCR 2基因条带。成功构建了去掉跨膜区的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM。诱导表达的GST-ChCR2-△TM蛋白在低温(16℃)诱导条件下可溶,而His-ChCR2-△TM蛋白以包涵体的形式存在。经ELISA测定,GST-ChCR2-△TM蛋白免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶512000。间接免疫荧光试验和Western blotting结果显示,制备的抗GST-ChCR2-△TM蛋白血清多克隆抗体可与ChCR2蛋白发生特异性结合。本研究结果为ChCR 2基因的进一步鉴定及鸡乃至禽类的相关免疫学研究提供了参考依据。

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白的原核表达及多抗制备

猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)是冠状病毒中的重要成员,也是引起猫传染性腹膜炎的主要病原.参考GenBank数据库中FIPV核衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,以病料组织中提取的RNA为模板,反转录成cDNA,通过PCR特异性扩增N基因序列,将其克隆至pMD19-T载体并转化至Trans5α感受态细胞,经筛选、菌液PCR与限制酶双酶切鉴定后,获得重组克隆质粒pMD19-T-N.以pMD19-T-N为模板,亚克隆N基因,将其与Pet-28a载体连接后转化至表达菌株Rosetta感受态细胞,完成Pet-28a-N重组表达质粒的构建.用IPTG诱导N蛋白表达,将纯化后的重组N蛋白皮下多点注射免疫比利时兔,制备多克隆抗体.最终通过Western-Blot与免疫组化技术检测多克隆抗体的特异性.FIPV N蛋白多克隆抗体的制备,为猫传染性腹膜炎的进一步研究及临床治疗提供了必备的实验材料.

Cry1Ie基因在大肠杆菌中的表达及等同性鉴定

目的以Cry1Ie基因表达蛋白为模式蛋白,建立外源基因表达蛋白的技术平台。方法利用大肠杆菌系统高效表达Cry1Ie蛋白,并采用SDS-PAGE技术分离纯化,通过生物学活性和免疫反应性2项指标检测了大肠杆菌表达蛋白与转基因玉米中蛋白的等同性。结果大肠杆菌表达系统可以产生大量的Cry1Ie蛋白,所获得的蛋白与转Cry1Ie玉米表达的Cry1Ie蛋白有相同的免疫反应性和生物活性。结论大肠杆菌表达系统可以作为Cry1Ie外源基因蛋白表达技术平台用于转基因植物食用安全性的初步研究。

兔抗人硒蛋白P抗体的制备与鉴定

目的 :以原核表达的人硒蛋白P片段 (HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法 :在E .coli中诱导表达HSelP片段 ,经DEAEfastflow和Ni NTA Agarose柱层析纯化后 ,以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体 ,并以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果 :成功地表达并纯化了HSelP ,制备的兔抗HSelP抗体可有效地检测天然的SelP。结论 :以原核表达并纯化的HSelP为免疫原 ,成功地制备了兔抗该蛋白的抗体 ,Westernblot鉴定特异性良好。为进一步研究硒蛋白P的功能。

神经系统RNA结合蛋白Musashi1 RRM1的初步结晶

目的对Musashi1发挥功能的RRM1结构域进行结晶,得到可用来衍射的蛋白晶体,为之后的结构解析打基础。方法通过构建Musashi1 RRM1的原核表达载体,并在BL21中表达、纯化高纯度的蛋白质,通过筛选结晶体条件得到蛋白晶体。结果通过系统筛选和优化晶体生长条件得到了蛋白晶体。结论Musashi1 RRM1的蛋白晶体质量较好,满足蛋白晶体衍射和数据收集的要求。

PDX-1蛋白对棕榈酸诱导的大鼠胰岛凋亡的保护作用

目的探讨PDX-1蛋白对棕榈酸诱导的大鼠胰岛凋亡的保护作用。方法PDX-1基因克隆及表达质粒的构建,PDX-1蛋白的表达、纯化和鉴定,PDX-1蛋白保护棕榈酸引起的胰岛细胞凋亡的研究。结果PDX-1蛋白可以延缓胰岛细胞的自然凋亡过程,保护其三维形态;可以降低处理后的胰岛Caspase-3活性,同时可以增加葡萄糖刺激胰岛素释放,PDX-1蛋白干预后的棕榈酸组(1.560±0.074)uIU/mL,与对照组(1.426±0.056)uIU/mL相比有显著差异(P<0.05)。结论表明PDX-1蛋白可以减少棕榈酸诱导的胰岛凋亡,保护β细胞功能。

人类重组PIF1蛋白的表达纯化和解螺旋酶活性的分析

Pif1解螺旋酶家族在酵母到人的进化中非常保守,在生物体内具有很多重要的生理作用。为了从生物化学水平研究人类PIF1的功能,从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到人类PIF1全长基因,通过共转化一个携带稀有遗传密码tRNA1的质粒和一个编码分子伴侣的质粒,增加了PIF1蛋白在大肠杆菌中的表达,最后通过快速液相色谱纯化系统,采用亲和层析和凝胶过滤,纯化了人类重组PIF1蛋白。生物化学活性检测证明了纯化的人类PIF1蛋白具有ATP酶及解螺旋酶活性。人类PIF1蛋白的纯化为我们从分子水平理解PIF1在体内的功能奠定了基础。

蛋白酪氨酸激酶NOK/STYK1胞内区的表达与纯化

目的:酪氨酸蛋白激酶NOK/STYK1具有很强的促肿瘤形成和转移能力,被认为是很有前途的肿瘤治疗靶点。由于NOK含有一个跨膜区,且富含疏水性氨基酸,其表达和纯化非常困难,直接影响了对其功能及相关分子机理的深入研究。本研究目的是获得可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白△NOK(AA:49-422),为后续抗体的制备和功能研究奠定重要基础。方法:含有△NOK基因的原核表达载体,转入E.coli BL21中,IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析获得可溶的△NOK融合蛋白。融合蛋白经凝血酶酶切后,凝胶过滤层析分离标签蛋白获得△NOK蛋白。同时,我们还通过Bac-to-Bac系统获得含有△NOK基因的杆状病毒,感染sf9细胞,尝试在真核细胞中表达目的蛋白。结果:通过在sf9昆虫细胞和大肠杆菌表达系统中盐浓度等各种条件的摸索,首次获得了可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白(△NOK-GST)和一定量去除标签的△NOK蛋白。本研究中与大肠杆菌相比,昆虫细胞并不适合△NOK的纯化。结论:我们建立了一套优化的NOK蛋白表达和纯化体系,从而为后续抗体制备和各种体内外生化实验等功能研究奠定基础,为研究NOK在肿瘤中的作用和药物筛选创造条件。同时丰富了整个RTKs家族作用机制的探索,进一步促进了以RTKs为靶点的治疗手段在临床上的应用。

人CD112(Nectin2/PRR2)单克隆抗体的制备和鉴定

目的：表达和纯化CD112 胞膜外区重组蛋白, 制备针对CD112胞膜外区的单克隆抗体（mAb）, 并且研究CD112的分布.方法：采用基因重组技术在真核系统表达CD112-Fc融合蛋白, 亲和层析法进行蛋白纯化;纯化的CD112-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 杂交瘤技术建立分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 间接ELISA、 Western blot及FCM鉴定mAb 的特异性.用流式细胞术（FCM）检测 CD112 的细胞系分布.结果：构建了高效真核表达载体pIg3C-CD112, 表达并纯化了CD112-Fc融合蛋白, 其纯度大于 90%.以纯化重组蛋白为免疫原共制备9株分泌抗CD112 mAb的杂交瘤细胞株（命名为FMU-CD112.1 ～FMU-CD112.9）, 制备腹水并纯化 mAb.FMU-CD112.1、 3、 6和8能用于Western blot, FMU-CD112.1、 4、 6和8可用于 FCM.CD112细胞分布检测显示该分子主要分布在正常上皮及内皮细胞系、巨核细胞谱系和部分T细胞系, 并高表达于上皮及内皮来源的肿瘤、胶质瘤等细胞系.结论：成功地表达纯化了CD112-Fc融合蛋白并建立了稳定分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 为CD112的功能研究打下坚实的基础.

苜蓿盲蝽气味分子结合蛋白AlinOBP2结合特性初步分析

昆虫具有灵敏的嗅觉系统,能够特异性地识别性信息素和寄主挥发物来进行寻找配偶、定位寄主植物和产卵位点.气味分子结合蛋白在昆虫嗅觉识别过程中发挥关键作用.本研究表达和纯化了一个新的苜蓿盲蝽气味分子结合蛋白AlinOBP2,采用qRT-PCR方法解析了AlinOBP2基因的表达谱,结果表明AlinOBP2绝大部分在触角中表达,且在雌雄触角中的表达量相当,在头部也有少量的表达.以N-phenyl-1-naphthylamine(1-NPN)为荧光探针,采用荧光竞争结合实验研究了5种性信息素类似物和13种棉花挥发物与AlinOBP2蛋白的结合能力.结果显示,5种性信息素类似物均不能和AlinOBP2有效结合,暗示AlinOBP2在苜蓿盲蝽寻找配偶过程中不发挥作用.在13种棉花挥发物中,庚酸乙酯和AlinOBP2的结合能力最强,结合常数为9.22μmol/L.二甲基萘、3-己酮、乙酸叶醇酯、乙酸壬酯、香芹醇5种化合物和AlinOBP2结合能力一般,结合常数分别为15.49,17.31,21.53,18.86和13.47μmol/L.据此推测,AlinOBP2可能为普通气味结合蛋白,能够选择性地结合某些棉花挥发物并参与苜蓿盲蝽识别普通气味过程.