转基因烟草蛋白表达系统的研究进展

随着分子生物学和基因工程理论等技术的迅速发展,转基因烟草可以表达越来越多的外源蛋白。就转基因烟草作为蛋白表达系统的基本方法、研究状况及发展前景进行概述。

杆状病毒蛋白表达系统制备可溶性LRIG1蛋白及其鉴定

目的为进一步研究肿瘤的治疗提供高质量的可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白(sLRIG1)。方法用重组sLRIG1的杆状病毒(Bac-sLRIG1)感染sf9昆虫细胞,表达的蛋白经提纯,获得sLRIG1蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹进行分析鉴定。结果使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)成功表达了重组sLRIG1蛋白,最佳感染复率为5,孵育时间为72 h,经鉴定蛋白表达正确,纯度高达95%。结论用BEVS可成功获得大量高纯度重组sLRIG1蛋白,可满足后续实验的需要。

L-型细菌蛋白表达系统

L-型细菌由于缺乏细胞壁以及具有的其它特殊生物学特性,通过连接合适的信号肽,可以用于许多外源蛋白的可溶性、功能活性形式的分泌表达。表达产物在培养基中,表达的产量依赖于不同的基因序列、载体、宿主和诱导表达条件等因素。此外,L-型细菌还能将具有功能活性的蛋白展示在胞浆膜表面。

粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究

旨在将模式丝状真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)构建为蛋白质表达系统。通过真菌杂交技术构建出粗糙脉孢菌六突变缺失菌株LQ-1(Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3)作为蛋白表达宿主菌株。该宿主菌株可以用纤维二糖作为诱导物诱导纤维素酶启动子表达,同时又消除了葡萄糖苷酶蛋白的背景条带,有利于目标蛋白表达纯化。构建了分别含有粗糙脉孢菌自身强启动子(Pcbh-1、Pcbh-2和Ptef-1)的3个新的高效表达载体,该载体带有融合标签蛋白tev-6×his-gfp,能高效方便的筛选阳性转化子,有利于后续目标蛋白纯化。以纤维素酶GH3-4和CBH-1为例,通过重组表达菌株纤维二糖诱导发酵液进行酶活测定、SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测显示,重组蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP成功进行了表达和分泌,分泌水平分别为2.77和2.83 mg/L。Pcbh-1启动子重组蛋白表达水平最高,说明在纤维二糖诱导体系中启动子Pcbh-1的启动效率最高,初步建立了粗糙脉孢菌纤维二糖诱导的蛋白质表达体系。

无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用

无细胞蛋白表达系统作为体外合成蛋白表达技术的一种,其基础是细胞抽提物。具备反应操控简便和遗传背景简单等诸多优点。经过大量研究人员的努力,无细胞蛋白表达系统取得新进展,具有较大潜力,可应用于生物制药工程。现就无细胞蛋白表达系统发展进程进行分析,总结该系统在生物制药工程中的应用。

用于药用蛋白生产的外源表达系统

利用外源蛋白表达系统生产具有重要价值的药用蛋白是现代生物技术产业的核心内容和研究热点,也是各国政府和制药企业竞相巨额资助的研究领域之一。本文综合分析了目前用于重组药用蛋白生产的原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统在表达产量、翻译后加工能力、生产周期、生产成本、适用范围等方面的优劣以及研究现状和最新研究进展,揭示出植物表达系统将在未来重组蛋白大规模生产中占据重要地位。但是现有的各种表达系统都无法单独实现各种重组蛋白高活性、低成本、安全系数高的大规模生产。在相当长时间里,各种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存。而通过遗传改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能,不断建立更加优越的外源蛋白表达系统则是大家共同努力的目标。

不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响

无细胞蛋白表达系统由于能够有效表达膜蛋白等有毒性蛋白,因此近二十年受到了关注,其蛋白表达产率有了显著的提高。细胞抽提物活性的高低是无细胞蛋白表达系统高效运行的关键,若找到简单易行的活性评估方法,将大大降低成本及时间。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PDH)是糖代谢的戊糖磷酸途径中的关键调控酶,该酶可以被用来评估细胞抽提物的活性。以G-6-PDH的活性为指标对无细胞蛋白表达系统中的抽提物活性进行评价,并利用G-6-PDH活性评价体系对机械破碎、高压破碎以及超声破碎三种破碎方法进行了比较,得出了三种破碎方法的最佳破碎条件。机械破碎最佳破碎条件是5000r/min,用直径0.1 mm玻璃珠,破碎6次;高压破碎的最佳破碎压力为1 300bar;超声破碎最佳破碎条件是功率强度为总功率的60%,破碎30次。酶活性测定结果显示机械破碎和超声破碎得到的抽提物活性比高压破碎得到的抽提物活性略高。

外源蛋白表达系统及利用植物表达外源蛋白的特点与优势

比较了大肠杆菌、酵母、昆虫细胞 /杆状病毒、哺乳动物细胞、动物乳腺以及植物等不同受体作为外源蛋白表达系统的优缺点 ,论述了植物外源蛋白表达系统的特点 ,阐明利用植物生产外源蛋白的潜在优势。

无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用

无细胞蛋白表达体系是一种以细胞抽提物为基础的体外合成蛋白质表达技术,具有遗传背景简单、反应操控简便等特点,已成为研究生物反应系统的重要技术手段。在研究人员的不断努力下,反应体系从原核扩展到真核蛋白质合成体系,而且目标蛋白表达量从毫克级提高到数克级每升,成本不断降低,反应规模可达到百公升级。近年来,无细胞蛋白表达系统在复杂蛋白、毒性蛋白和膜蛋白表达方面的优势逐渐体现,展示了其在生物制药领域的重要应用潜力。总之,无细胞技术已经成为异源蛋白质高效合成和生物制药领域中有巨大潜力的新策略。

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素的方法研究

目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线。方法用pTh ioH is-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-pylth io-galactoside,IPTG)诱导表达重组融合蛋白,或诱导表达不同时间后,采用SDS-PAGE分析表达产物;按所优化的条件进行重组内皮抑素的表达、包涵体的提取、洗涤、变性和复性,最后经N i+柱纯化,再通过SDS-PAGE分析纯化的结果。结果3种大肠杆菌表达效果相差无几,最佳IPTG的浓度0.9 mmol/L,最佳诱导时间为5 h,经N i+柱纯化后可获得可溶性的重组内皮抑素。结论利用本实验的优化条件可获得高产量、高纯度、可溶性的小鼠内皮抑素重组蛋白。

利用爪蟾卵母细胞建立人类低密度脂蛋白受体基因表达系统

目的 在爪蟾卵母细胞中建立人类低密度脂蛋白受体基因的表达系统,此系统可被用于降血脂和抗动脉粥样硬化的研究。方法和结果 冰块麻醉爪蟾,切取卵巢,获得V、VI期卵母细胞,经用1g/L胶原酶孵育过夜除去卵母细胞外层的卵巢膜和滤泡膜,培养3天后存活率仍可达95 %以上。用DiI标记的低密度脂蛋白荧光配体测定膜上结合荧光,发现V、VI期卵母细胞膜上未见有内源性低密度脂蛋白受体,如将人低密度脂蛋白受体的表达质粒p3.7低密度脂蛋白导入爪蟾卵母细胞核中,培养后用DiI标记的低密度脂蛋白配体测定可见膜上发出红色荧光,用抗低密度脂蛋白受体的抗体经免疫荧光检测法测定可见膜上有绿色荧光,免疫胶体金标记透射电镜检测可见膜上有内吞的胶体金颗粒。结论 外源性的人类低密度脂蛋白受体基因能在爪蟾V、VI期卵母细胞中表达,此低密度脂蛋白受体基因表达系统可用于中药降血脂抗动脉粥样硬化机理的研究。

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)。方法采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定。结果高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L。结论用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性。

硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定

目的:将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方法:将含有pThioHis-endo重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,加入重组蛋白内皮抑素5μg组与10μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)%和(47.1±4.0)%,P<0.05,和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义;内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用[抑制率分别为(49.6±4.1)%,(53.2±2.3)%,(55.0±3.6)%,(67.1±5.7)%],经过方差分析和相关性分析,具有剂量依赖效应(r=0.984,P<0.05).结论:用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.

利用植物表达外源蛋白需解决的几个关键问题

植物外源蛋白表达系统已取得较大进展。目前已经能够利用转基因植物表达和生产多种外源蛋白,但仍存在诸多难以克服并急需解决的技术问题。作者从植物组织再生率、转化频率、调控元件、转基因植物遗传稳定性及其潜在的安全性问题、外源蛋白在植物体内的表达、调控、稳定性及其下游加工问题等方面综述了植物外源蛋白表达系统存在的问题和应对策略,为进一步开发、利用转基因植物生产外源蛋白提供理论依据。

Waters公司蛋白质表达系统

Warers蛋白质表达系统整合了具有领先地位的高效能的直接纳升流色谱和具有最优化的分辨率及最大灵敏度的可以快速可靠地进行准确质量测定的oa-TOF。Waters nanoACQUITY Ultra Performance LC^TM系统和Waters Micromass

TRAIL的作用机制及其表达系统

TRAIL能诱导膀胱癌、前列腺癌及鼻咽癌等多种肿瘤细胞凋亡,但是对正常的细胞没有影响,因此,TRAIL及其受体的发现为肿瘤治疗提供了新的思路和方法。

f3b基因表达下调斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2、Huc的表达观察

目的观察f3b基因表达下调斑马鱼胚胎中枢神经系统少突胶质细胞转录因子2(olig-2)、神经系统特异表达RNA结合蛋白(Huc)的表达情况。方法将单细胞阶段的斑马鱼胚胎随机分为两组(胚胎数量分别为90枚和85枚),分别注射针对f3b起始密码区域序列的吗啡啉反义核苷酸(ATG-MO)和作为标准对照的随机序列吗啡啉反义核苷酸(CON-MO)。在CON-MO注射后的斑马鱼胚胎中随机挑选20枚受精后24 h的胚胎作为对照组,在ATG-MO注射后出现特异表型的斑马鱼胚胎中随机挑选20枚受精后24 h的胚胎作为实验组,通过原位杂交的方法检测两组斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2、Huc。结果实验组、对照组斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2表达评分分别为(1.9±0.4)、(5.6±0.5)分,两组比较,P<0.01。实验组、对照组斑马鱼胚胎中枢神经系统Huc表达评分分别为(6.3±0.6)、(6.5±0.3)分,两组比较差异无统计学意义。结论 f3b基因表达下调斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2表达减弱、Huc表达无明显变化。