中药海尔福、元首复方制剂对麦芽酚铝染毒小鼠β-淀粉样蛋白裂解酶1活性影响的实验研究

探讨中药复方海尔福、元首制剂对麦芽酚铝染毒小鼠β-淀粉样蛋白裂解酶1活性的影响。方法:选择50只SPF级KM品种小鼠为实验小鼠。前期试验阶段,实验小鼠随机分为十组,每组5只,除空白对照编号1、编号2组外,其余八组小鼠用30mmol/L浓度的麦芽酚铝溶液进行腹腔注射,每次按48mg/kg·d腹腔注射(30g体重小鼠每只0.2mL),每连续注射3天休息1天。建立模型30天后,进入后期实验,将小鼠分为正常组、模型组、治疗1组、治疗2组。治疗1组用中药复方海尔福制剂灌胃治疗,治疗2组用中药复元首制剂灌胃治疗,每天一次,连续30天。实验前期,所有组的小鼠进行水迷宫实验训练,确保全部小鼠熟练上岸,建立记忆。实验中、后期不再训练,直接进行连续3天水迷宫测定,每天三次,直至实验结束。记录所有小鼠游水时间和错误次数,以此来测定模型建立前、模型建立后和治疗后水迷宫游水时间和错误次数,作为小鼠记忆力变化的判断。实验结束,处死动物,体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的活性。结果:依正常组、模型组、治疗1组、治疗2组顺序,脑β-淀粉样蛋白裂解酶1(BACE1)活力分别为(30.14±3.00)、(32.86±3.75)、(27.00±4.10)▲▲、(28.38±4.16)▲。方差分析:F=2.872,P=0.052,与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,差异有统计学意义。结论:中药复方海尔福、元首制剂对麦芽酚铝染毒小鼠β-淀粉样蛋白裂解酶1活性存在影响,治疗后明显降低。

颅脑损伤患者血清αⅡ血影蛋白裂解产物(SBDPs)水平检测的临床意义

目的分析脑外伤患者血清中αⅡ血影蛋白裂解产物(SBDPs,包括SBDP120和SBDP145)水平,探讨其对该病尤其是轻型脑外伤患者的临床价值。方法采用酶联免疫吸附法检测43例重型脑外伤(sTBI)患者、43例轻型脑外伤(mTBI)患者和43例常规体检正常者(对照组)血清SBDP145和SBDP120水平,受试者工作特征曲线(ROC)评估SBDPs对sTBI,mTBI,判断头颅CT阴性和阳性患者的辅助诊断效能。结果三组间血清SBDP145水平差异无统计学意义(F=1.340,P>0.05)。对照组,mTBI及sTBI SBDP120含量分别为7.06±2.23,11.67±9.14和12.64±11.44 ng/ml。与对照组相比,sTBI组(F=9.873,P=0.001)和mTBI组(F=9.873,P=0.008)血清SBDP120均显著升高,差异有统计学意义;但sTBI组和mTBI组间SBDP120水平差异无统计学意义(F=9.873,P=0.515>0.05)。SBDP120鉴别TBI和对照组的AUC为0.781(95%CI:0.690~0.872,P<0.001);鉴别mTBI和对照组的AUC为0.736(95%CI:0.624~0.848,P<0.001);鉴别头颅CT阴性和阳性患者的AUC为0.709(95%CI:0.582~0.837,P=0.007<0.01)。结论轻型脑外伤患者血清SBDP120水平显著升高,是潜在的轻型脑外伤辅助诊断生物标志物。

电针对SAMP8小鼠行为学及大脑皮层β位淀粉样前体蛋白裂解酶表达的影响

目的探讨电针治疗阿尔茨海默病的可能作用机制。方法将快速老化小鼠P8亚系(SAMP8)36只随机分为模型组、电针组和药物组,抗快速老化小鼠R1亚系(SAMR1)12只为正常组。电针组给予电针百会穴、印堂穴20 min后,点刺水沟穴;药物组给予盐酸多奈哌齐按0.92 mg·kg-1剂量灌胃;正常组和模型组给予电针组相同程度和时间的束缚。治疗15 d后,用Morris水迷宫测定小鼠学习记忆能力,免疫组化技术检测小鼠大脑皮层β淀粉样蛋白(Aβ)及β位淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE-1)含量,实时荧光定量PCR法测定BACE-1 mRNA的表达。结果与模型组比较,药物组与电针组逃避潜伏期均显著下降,而目标象限游泳时间均显著增加(P<0.05),电针组BACE-1、BACE-1 mRNA表达显著减少(P<0.05);电针组游泳总路程、游泳速度明显下降,与药物组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论电针可能通过抑制SAMP8小鼠大脑皮层BACE-1表达,降低Aβ水平,达到改善其学习记忆障碍的作用。

PCI术前 术后血管性血友病因子及其蛋白裂解酶水平分析

目的通过检测经皮冠状动脉介入(PCI)术前、术后冠心病患者血浆中血管性血友病因子(vWF)及其裂解酶(vWFcp)水平,了解其与冠心病及PCI术的关系。方法根据冠脉造影结果将研究对象分对照组(造影正常)及PCI组(经造影确诊为冠心病并行PIC术),通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆vWF浓度和及血浆vWF-cp活性水平并进行统计分析。结果术前、术后PCI组血浆vWF水平明显高于对照组,PCI术后血浆vWF水平明显高于PCI术前(P<0.05)。PCI组vWF-cp活性水平较对照组降低,而PCI术后低于PCI术前(P<0.05)。血浆vWF水平随冠心病变严重程度而升高,vWF-cp活性水平随之降低。结论 vWF及vWF-cp水平随冠脉病变严重程度及血栓风险不同呈增高和减低趋势,在急性冠脉综合征的发病过程中可能起重要作用。PCI术后vWF及vWF-cp水平变化,提示介入治疗一定程度上可增加血栓形成风险。

真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达

目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(β-siteamyloidprecursorproteincleavingenzyme,BACE)基因的真核表达载体,为修复阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)损伤神经元奠定基础。方法采用RT-PCR方法,从人的成神经细胞瘤的总cDNA中,扩增出1.5kb的BACEcDNA片段,再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况。结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中;经脂质体转染COS-7细胞后,并由潮霉素进行筛选,可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。结论成功构建了pcDNA3.1-BACE的真核表达载体,为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE,为治疗AD奠定一定的实验基础。

毛白杨形成层总蛋白裂解及蛋白含量测定方法优化

通过TCA/丙酮法研磨提取获得毛白杨形成层总蛋白质粉末。在室温和冰浴条件下,用不同的裂解液对粗提总蛋白进行裂解,分别在1,2及3h取出裂解蛋白液。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳对蛋白质裂解情况进行检测、比较与分析,获得了蛋白质最适裂解条件为:蛋白裂解液(8mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,65mmol/L DTT,2%Bio-lyte)在室温条件裂解3h。同时对蛋白质含量测定方法-Bradford法及2种改良的Bradford方法进行了比较,最终获得了用裂解缓冲液配制蛋白质标准曲线系列溶液以降低本底干扰的优化蛋白质含量测定方法。

胰岛素样生长因子-1对β-淀粉样前体蛋白裂解酶1的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme1,BACE1)的影响以及可能的细胞信号机制。方法:用不同剂量IGF-1(20、40 ng/ml和80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 24 h,荧光定量PCR及Western blot检测BACE-1mRNA及蛋白水平;Western blot检测淀粉样前体蛋白、C99、C83及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3-kinase/serine threonine kinase,PI3-K/Akt)通路相关蛋白的水平;ELISA检测细胞培养液中β-淀粉样蛋白42(β-amyloid peptide,Aβ42)的水平,然后选择最佳剂量的IGF-1(80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,在此之前30 min加入PI3-K抑制剂LY294002(25μmol/L及50μmol/L),重复上述检测。结果:IGF-1降低BACE-1、C99及Aβ42的水平(P=0.000),提高C83的表达(P=0.000),增加Akt的磷酸化(P=0.000),而LY294002具有抑制IGF-1的上述作用。结论:IGF-1降低BACE-1mRNA及蛋白的水平,其机制可能涉及PI3-K/Akt信号通路。

甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白基因异亮氨酸796缬氨酸多态性与冠心病、高脂血症的相关研究

目的 :研究湖北汉族人群甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白 (SCAP)基因异亮氨酸 (Ile) 796缬氨酸(Val)多态性 ,探讨该多态性与冠心病、高脂血症的关系。方法 :应用PCR RFLP的分析方法 ,检测 1 5 0名湖北汉族体检健康者、1 32例冠心病和 6 6例高脂血症患者SCAP基因Ile796Val的等位基因频率。结果 :①冠心病、高脂血症、对照组等位基因A的频率分别为 0 .4 5 ,0 .4 8,0 .32 ,等位基因G的频率分别为 0 .5 5 ,0 .5 2 ,0 .6 8。②冠心病、高脂血症与对照组之间的基因型和等位基因的频率差异均有显著性差异 (P <0 .0 5 )。③冠心病、高脂血症组内AA基因型的TC水平明显高于GG基因型的TC水平 (P <0 .0 5 )。结论 :SCAP基因Ile796Val多态性与冠心病、高脂血症密切相关。提示SCAP基因A等位基因与血浆高胆固醇有着密切的关系 ,可能是罹患高脂血症、冠心病的危险因子。

β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用

目的构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2(β-site APP-cleaving enzyme 2,BACE2)基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法运用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼中设计针对靶点的gRNA,使之诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果BACE2纯合突变体在早期部分无法存活,RT-PCR结果显示BACE2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论 BACE2基因敲除的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。

外源性硫化氢对嗜铬细胞瘤细胞β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的观察外源性硫化氢(H2S)对嗜铬细胞瘤细胞(PC12)β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响,并探讨可能涉及的细胞信号机制。方法用不同浓度的硫氢化钠(NaHS)处理体外培养的PC12细胞,利用RT-PCR和Western blot法检测细胞内BACE1mRNA及蛋白表达;继以LY294002和PD98059分别阻断磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Ak)t及丝裂酶原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2(MAPK/ERK1/2)通路,Western blot法检测其对NaHS诱导的通路下游蛋白Akt1和ERK1/2磷酸化的影响及其对BACE1蛋白表达变化的调节;ELISA法检测细胞培养液中Aβ42水平的变化。结果 NaHS在实验浓度范围内呈剂量依赖性下调BACE1mRNA及蛋白表达,200μmol/L时最明显,各NaHS组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);LY294002抑制NaHS诱导的Akt1蛋白磷酸化,削弱NaHS对BACE1蛋白的下调作用,其表达在LY294002预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);而PD98059虽能抑制NaHS导致的ERK1/2蛋白磷酸化,但对其调节BACE1蛋白表达无影响,PD98059预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异无统计学意义(P>0.05);不同处理条件下的Aβ42表达与BACE1变化趋势基本一致。结论外源性H2S下调PC12细胞BACE1表达,其机制可能与PI3-K/Akt信号通路的激活有关,而与MAPK/ERK1/2通路无关。

芝麻素对低氧条件下鼠嗜铬细胞瘤细胞β淀粉样蛋白和β位淀粉样前体蛋白裂解酶-1表达影响的实验研究

目的:探讨芝麻素对低氧条件下鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)β淀粉样蛋白(Aβ)和β位淀粉样前体蛋白裂解酶-1(BACE-1)表达的影响。方法:PC12细胞随机分为正常氧组、低氧组、低氧加芝麻素0.5、5.0和50μmol/L浓度干预组,采用酶联免疫吸附法测定(ELISA)检测Aβ1-42水平,免疫印迹试验(Western blot)检测BACE-1蛋白表达。结果:低氧组Aβ1-42水平高于正常氧组(P<0.05),在0.5、5和50μmol/L浓度芝麻素干预后,低氧组Aβ水平降低(均P<0.05);低氧组BACE-1的蛋白表达高于正常氧组(P<0.05),在0.5、5和50μmol/L芝麻素干预后,低氧组BACE-1蛋白水平降低(均P<0.05)。结论:在低氧条件下,PC12细胞Aβ1-42、BACE-1蛋白表达升高,芝麻素降低低氧条件下升高的Aβ1-42,BACE-1表达。

血清αⅡ血影蛋白裂解产物检测在早产儿脑损伤中的临床意义

目的探讨血清αⅡ血影蛋白裂解产物(SBDPs)对早产儿脑损伤的诊断及病情严重程度评估的临床价值。方法选取早产儿64例,根据头颅影像学检查分为脑损伤组和对照组,其中脑损伤组又分为轻度脑损伤组和重度脑损伤组。采用酶联免疫吸附试验检测各组早产儿血清SBDP120、SBDP145水平。结果脑损伤组早产儿SBDP120、SBDP145水平均高于对照组,NBNA评分低于对照组(P均<0.05);重度脑损伤组早产儿SBDP120、SBDP145水平均高于轻度脑损伤组,NBNA评分低于轻度脑损伤组(P均<0.05)。SBDP120、SBDP145水平与NBNA评分均呈负相关(r=-0.56、-0.46,P均<0.05)。SBDP120、SBDP145诊断早产儿脑损伤的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.97(0.635,0.886)和0.77(0.664,0.891)(P均<0.05),截断值分别为1.55 ng·mL-1与1.35 ng·mL-1,敏感度分别为86.1%与95.7%,特异度分别为96.7%与85.3%。结论SBDP120和SBDP145对早产儿脑损伤的诊断及病情严重程度评估有一定的临床价值。

海马高级糖基化终末产物受体和β-淀粉样前体蛋白裂解酶表达增加与自发性高血压大鼠认知功能损害相关性研究

目的:研究海马区域RAGE蛋白与BACE蛋白异常表达与自发性高血压大鼠(SHR)认知功能损害之间的关系。方法:采用SHR大鼠与正常血压大鼠(NWR)进行相关研究,增强型磁共振成像(MEMRI)检测大鼠海马脑区生理活动。采用Morris水迷宫、新事物识别实验分析大鼠的认知功能。使用Western blot分析海马区域高级糖基化终末产物受体(RAGE)与β-淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)蛋白的表达水平。使用免疫蛋白反应对NWR以及SHR大鼠脑切片进行Aβ斑块染色。结果:SHR相比NWR组,大鼠海马脑活动明显减少(0.698与1.499,P<0.01);Morris水迷宫中,SHR组大鼠在测试阶段对平台的寻找时间显著延长(35.3与12.2,P<0.01);新事物识别实验中,SHR组大鼠对新物体的探索时间显著降低(13.7与31.5,P<0.01);通过检测NWR与SHR组中大鼠海马区域RAGE与BACE蛋白的表达水平,发现RAGE与BACE的表达均有显著升高(0.407与0.789,P<0.05;0.733与1.502,P<0.01);对两组大鼠进行切片染色,发现SHR大鼠海马区域有大量Aβ阳性的斑块沉积。结论:SHR大鼠海马功能低下导致认知功能受损,与海马区域RAGE、BACE蛋白表达增加、Aβ斑块沉积有关。

电针对APP/PS1小鼠学习记忆及β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的探讨电针治疗阿尔茨海默病的效果和作用机制。方法雄性8月龄APP/PS1小鼠24只随机分为模型组、电针组和非穴组,各8只。8只野生型小鼠为野生组。电针组电针百会、神庭,非穴组电针双侧肋下非穴区,野生组和模型组予相同抓取和固定,共28 d。干预后,Morris水迷宫测试小鼠学习记忆能力,分别采用免疫荧光和免疫组化技术检测小鼠大脑皮质β淀粉样蛋白(Aβ)和β位淀粉样前体蛋白裂解酶1 (BACE1)含量,RT-PCR检测BACE1 m RNA水平。结果与模型组比较,电针组小鼠Morris水迷宫逃避潜伏期显著下降(P <0.001),穿越平台次数显著增加(P <0.001),BACE1表达和Aβ水平显著减少(P <0.001)。结论电针百会、神庭可能通过抑制APP/PS1小鼠大脑皮质BACE1表达,降低Aβ水平,改善小鼠学习记忆能力。

循环间歇性低氧对大鼠肾上腺β淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的观察β淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)在大鼠肾上腺的表达和定位,检测循环间歇性低氧(CIH)对BACE1表达的影响。方法采用Western blotting和免疫组织化学法检测BACE1在大鼠肾上腺的表达及定位;16只雄性SD大鼠随机分为2组,常氧对照组(control组)和CIH模型组,每组8只。模型制作2周,Western blotting检测各组大鼠肾上腺髓质BACE1和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达量。结果BACE1主要定位于大鼠肾上腺髓质神经纤维;与control组相比,CIH组大鼠肾上腺髓质BACE1蛋白水平下降,TH蛋白水平升高(P<0.05)。结论BACE1定位于大鼠肾上腺髓质神经纤维;BACE1水平下调可能参与减缓CIH引起的交感神经活性过度增强。

β淀粉样前体蛋白裂解酶1在大鼠颈上神经节组织中的表达

目的 观察β淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)在大鼠颈上神经节的表达和定位,及慢性间歇性低氧(CIH)对BACE1表达水平的影响。方法 采用RT-PCR、Western blotting和免疫组织化学法检测颈上神经节BACE1的表达及分布。16只雄性SD大鼠随机分为对照(control)组和CIH组,每组8只,模型制作2周,RT-PCR检测CIH对BACE1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)mRNA水平的影响。结果 BACE1表达于大鼠颈上神经节,主要分布于卫星胶质细胞和神经纤维,而在血管、神经元和小强荧光(SIF)细胞不表达。CIH下调BACE1 mRNA水平,上调PGC-1αmRNA水平(P<0.01)。结论 BACE1定位于大鼠颈上神经节卫星胶质细胞和神经纤维;BACE1水平降低可能参与调节CIH诱导的颈上神经节突触的可塑性。

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因光敏生物素探针的制备及初步应用

将重组质粒ｐＵＣＬａＦｃ和ｐＵＣＦ４６Ｆｃ用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ酶切，回收新城疫病毒融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因，将此Ｆｃ片段用光敏生物素标记，制备出Ｆｃ探针。该探针能够与新城疫病毒（ＮＤＶ）的强毒株Ｆ４６Ｅ９、中毒株Ｍ株和弱毒株ＬａＳｏｔａＥ４株杂交，而不与对照的传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒杂交，说明探针是特异的。用ｐＵＣＬａＦｃ的Ｆｃ探针检测了各５份ＮＤＶ强中弱毒株的尿囊液，均为阳性。但强毒株和弱毒株的Ｆｃ探针都能与所用的强、中、弱毒株杂交，说明该Ｆｃ探针尚不能区分强、弱毒株。

表观遗传和蛋白质翻译后修饰对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达调控的研究进展

β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)最早于1999年被发现鉴定,它是催化β淀粉样蛋白(Aβ)生成的关键限速酶,而Aβ单体的异常聚集所形成的淀粉样斑块是阿尔茨海默病(AD)的典型病理特征。在AD患者的大脑及体液中BACE1的浓度及活性异常增高,BACE1在AD的病理级联过程中发挥重要作用。因此,BACE1是减少Aβ生成,改善早期AD的重要药物靶标。

酪蛋白裂解酶P对变异链球菌致龋性的影响

变异链球菌是人类龋病的主要致病菌,不仅在数量上优势明显,而且其产酸和耐酸能力较强,其生物膜黏附于牙表面是其毒性致龋的首要步骤。酪蛋白裂解酶P(ClpP)是细菌体内一种介导蛋白质水解的热休克蛋白,可清除细菌体内的变性蛋白质,影响细菌的生物膜形成并且在细菌对生存环境的诸多应激反应中发挥着一定的作用。本文就ClpP,变异链球菌ClpP,其他致病微生物的ClpP等研究进展作一综述。