化学发光技术在蛋白质组学研究中的应用

目的:探讨在蛋白质组学研究中应用化学发光技术分析鉴定蛋白质的方法和价值。方法:采用细胞培养、双向电泳及银染等技术建立小鼠神经元蛋白质组图谱,再用PDQuest 2D分析软件和免疫印迹持久性化学发光技术选择性地鉴定三种小鼠神经元蛋白质-PI3Kr3、MEK1、PKCα。结果:三种蛋白质的双向电泳化学发光图谱上均只出现了1个特异蛋白质斑点,信号强,背景低。结论:利用化学发光技术鉴定蛋白质简单、实用、灵敏、高效,可为蛋白质组学的研究提供有力的技术支持。

大豆分离蛋白对果蝇寿命的影响(英文)

背景:大豆蛋白具有降血脂、抑制肿瘤以及雌激素样作用等各种保健功效,但有关大豆分离蛋白对机体寿命影响的研究少见报道。目的:观察大豆分离蛋白对果蝇寿命的影响,以探讨其抗衰老与抗氧化作用机制。设计:以果蝇为研究对象的对照实验研究。单位:一所大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室。材料:实验于2002-03/06在新疆医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室果蝇室完成。美国野生型黑腹果蝇400只,雌、雄各半,由新疆医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室提供。方法:将400只果蝇分为1个对照组普通培养基和3个剂量组(分别()为基础培养基含0.2%,1.0%,5.0%大豆分离蛋白)。从实验第2天起,每天观察记录果蝇生存数和死亡数,直到全部果蝇死亡为止。计算果蝇平均寿命、半数死亡期和最高寿命。主要观察指标:果蝇平均寿命、半数死亡期和最高寿命。结果:与对照组相比,大豆分离蛋白明显延长了雌雄果蝇寿命,并呈剂量反应关系,以高剂量组作用明显,其中雌雄果蝇平均寿命分别延长24.5%和20.7%;半数死亡时间分别延长27.1%和22.0%;最高寿命分别延长13.9%和10.6%。结论:大豆分离蛋白能延长果蝇寿命,可能具有一定的延缓衰老作用。

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立

目的建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺。方法高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的蛋白。结果纯化后的STH纯度为98%以上,纤溶比活性2.6×104IU/mg,活性回收率56%。结论建立了STH的纯化工艺,该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产。

重组蛋白MSH-Ang的构建表达和纯化分析

目的对重组蛋白促黑激素-血管生成素(Melanocyte stimulating hormone-Angiogenin,MSH-Ang)的表达条件、发酵条件和纯化方法进行研究。方法通过化学方法偶联或基因融合表达的方法将靶向物质与毒性分子的蛋白连接起来制备融合蛋白。结果重组蛋白MSH-Ang在表达菌BL21(DE3)中以可溶的形式存在,需要诱导表达条件。结论经过层析和纯化可以提高表达率。

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE30中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行TricineSDSPAGE电泳分析和WesternBlot检测分析.结果构建了重组融合表达质粒pQE30Tum5,表达的蛋白经TricineSDSPAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.

人成釉蛋白C端肽的大量表达及纯化

目的:获得高纯度的重组人成釉蛋白C端肽。方法:实验于2001-01/2004-06在解放军第四军医大学口腔内科实验室解放军第四军医大学基础部生物化学与分子生物学实验室完成。①转化pRSET-A/成釉蛋白原核表达质粒入BL21(DE3)细菌进行大量培养,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L,32℃继续振荡诱导培养5h,收集细菌,诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱Ni-NTA结合蛋白,收集洗脱蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。②离子交换层析缓冲液(pH 7.4,50 mmol/L Tris·Cl)平衡Q SapharoseHP层析柱,将初步纯化的蛋白样品加在Q Sapharose HP凝胶介质上,梯度洗脱结合的蛋白,收集洗脱峰,制样,聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定洗脱蛋白。结果:①表达重组人成釉蛋白C端肽的金属螯合亲和层析结果:诱导菌体的裂解上清经金属螯合亲和层析,洗脱下Ni-NTA结合蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳证实获得初步纯化的重组人成釉蛋白C端肽,其中仍含一些杂蛋白。②重组人成釉蛋白C端肽的离子交换层析结果:获得多个蛋白洗脱峰,聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯化的重组人成釉蛋白C端肽。结论:获得了纯化的人成釉蛋白重组蛋白。

重组人C22orf37融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人C22orf37基因的原核表达载体,表达并纯化C22orf37重组蛋白.方法:应用PCR方法从人外周血白细胞cDNA文库中获得人C22orf37基因,成功构建人C22orf37融合表达载体,诱导表达His-C22orf37融合表达蛋白并对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot鉴定.应用镍螯合层析法纯化重组融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析.结果:成功构建了人C22orf37重组融合载体pQE30-C22orf37,工程菌pQE30-C22orf37/DH5α经IPTG诱导后的菌体蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约18 000处出现了一条新生的蛋白条带,Western Blot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合.应用Ni-NTA层纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白经Primer Premier软件分析纯度约80%.结论:成功构建了人C22orf37的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化了人C22orf37的融合蛋白,为下一步的C22orf37 mAb的制备和C22orf37蛋白表达的组织分布及功能研究奠定了基础.

HSA/IL1ra融合蛋白的纯化及生物学活性研究

目的:纯化HSA/IL1ra融合蛋白并对其生物学活性进行检测。方法:采用亲和层析及离子交换层析分离纯化HSA/IL1ra融合蛋白,检测其对IL1引起的对A375 S2的杀伤保护作用。结果:获得的HSA/IL1ra融合蛋白HPLC纯度在98%以上,并且具有与天然IL1ra相似的、对IL1杀伤A375 S2细胞的保护作用。结论:获得高纯度的HSA/IL1ra融合蛋白并且具有相应的生物学活性。

rhBMP-2m在高浓度条件下的复性

目的:优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽(rh-BMP-2m)的复性条件.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH,氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性.透析复性后进行非还原的SDS-PAGE,检测rhBMP-2m活性形式二聚体的含量,同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22μm微孔滤膜除菌并计算其损失率.结果:经透析复性后rhBMP-2m完全可溶,而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右,即复性后二聚体的rhBMP-2m可以达到每升发酵液800 mg,并且经微孔滤膜除菌后rhBMP-2m活性形式二聚体的含量基本没有损失,同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%.结论:高pH有利于rhBMP-2m的复性,除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP-2m复性后仍保持可溶.蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大,但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.

小鼠肠癌HSP70多肽复合物的纯化及其抗肿瘤免疫效应

目的:应用AKTA-purifier100液相层析系统,建立分离和纯化热休克蛋白70(HSP70)多肽复合物的方法,并观察其抗肿瘤免疫保护效应。方法:采用DE-AE-Sepharose离子交换层析和ADP-Ag-arose亲和层析,从热处理的BALB/c鼠源性结肠癌细胞(CT26)制备裂解液中分离、纯化HSP70多肽复合物,并通过主动免疫保护实验观察其抗肿瘤免疫效应。结果:纯化蛋白经鉴定为相对分子质量70×103左右的HSP70多肽复合物;平均1g湿重肿瘤细胞可获得63.63μgHSP70多肽复合物;HSP70主动免疫的小鼠可抵抗CT26细胞的攻击。结论:用此层析法可分离纯度较高的HSP70,并可诱导明显的抗肿瘤免疫保护效应。

大肠杆菌表达的重组人BMP-2和hBMP-4成熟肽大规模制备方法的比较

目的:大规模制备人骨形成蛋白成熟肽(hBMP-m):hBMP-4m和hBMP-2m.方法:两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP-4m和hBMP-2m的质粒,分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,离心收集菌体,悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次.预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解,上Sepharose SP-FF阳离子柱.结果:发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3.SOS-PAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的40.0%,hBMP-2m占细菌总蛋白量的47.2%.洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的82.9%,hBMP-2m占蛋白量的84.5%.上Sepharose SP-FF阳离子柱后,分别收集0.35 mol/L NaC l和0.20 mol/L NaC l洗脱部分,获得纯度为96%的hBMP-4m及纯度为95%的hBMP-2m.其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液;收得率分别为34.33%和34.81%.结论:大规模制备hBMP-4m和hBMP-2m时,使用相同的发酵程序及相近的纯化方法,都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度.

Triton X-114用于去除内毒素的研究

目的探讨规模化生产原核表达重组蛋白的Triton X-114去除细菌内毒素的方法与效果。方法以大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b、重组人生长激素、重组葡激酶蛋白粗提液为原料,采用反复抽提相分离法,研究Triton X-114去除细菌内毒素的效果。结果经一次Triton X-114抽提,能够去除蛋白粗提液中95%的细菌内毒素,蛋白收率保持85%以上,蛋白性质不受影响。结论 Triton X-114反复抽提相分离法能够有效地去除细菌内毒素,适合于规模化原核重组蛋白的生产。

肿瘤细胞热休克蛋白70多肽复合物的提纯

目的探讨从人肺腺癌传代细胞系GLC-82细胞提纯热休克蛋白70用以制备肿瘤特异性抗原。方法培养GLC-82细胞,43℃30 min热休克诱导HSP表达,低温高速离心、DEAE-52、Sephdex G-200层析法提纯HSP-70,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和ELISA法进行定量及定性检测。结果未经过热休克处理的GLC-82细胞提取HSP-70得率约为57μg/ml,适当的热休克处理后GLC-82细胞HSP-70得率约为75μg/ml。升高温度或延长时间均会导致细胞凋亡。结论热休克处理可以增加肿瘤细胞HSP-70的表达。

人源瞬时受体电位M2型通道Nudix水解酶9同源结构域的提取和纯化

目的:摸索人源瞬时受体电位M2型通道(TRPM2)羧基端Nudix水解酶9(NUDT9)同源结构域(NUDT9-H)的蛋白提取和纯化方法。方法:异丙基硫代半乳糖苷诱导表达的Rosetta(DE3)大肠埃希菌菌株经超声破碎和离心后,将收集到的上清液与GST磁珠结合并用还原型谷胱甘肽洗脱以抽提GST-NUDT9-H融合蛋白,浓缩离心后再经分子排阻色谱层析纯化,最后经凝血酶酶切并与GST磁珠结合即得NUDT9-H蛋白。结果:含有0.5%的十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)裂解溶液体系和0.025%的DDM分子排阻层析色谱溶液体系能够提高GST-NUDT9-H融合蛋白的稳定性,再按每2 mg融合蛋白加入1 U凝血酶切割24 h,即获得高纯度NUDT9-H蛋白。结论:NUDT9-H蛋白稳定性较差,提取和纯化体系中需添加DDM以稳定其构象从而提高目的蛋白的产量和纯度。