粗穗披碱草1H^tS染色体的蛋白质二硫键异构酶基因CAPS标记

中国春-粗穗披碱草罗伯逊1Ht S.1BL易位系高抗小麦条锈病、叶锈病和白粉病。为了获得抗病小片段易位系,用中国春ph1b基因缺失突变体对1Ht S.1BL进行了诱导,获得了大量诱导后代。本研究用位于小麦1DS染色体的87个EST-STS标记对中国春、粗穗披碱草和1Ht S.1BL易位系进行分析,未发现多态性标记。对其中扩增较好的引物BE444859的PCR产物进行随机克隆测序,获得了14个序列,与已发表的小麦蛋白质二硫键异构酶基因序列具有97%以上的同源性,14个序列均包含3个外显子和2个内含子。限制性酶切位点分析表明,仅2个序列含有HaeIII酶切位点。验证实验结果表明,BE444859/HaeIII组合可以在供试材料中获得多态性。进而用BE444859/HaeIII对一套中国春-粗穗披碱草附加系和151株诱导后代材料进行分析,结果显示,特异多态性条带仅出现在含1Ht S的材料中;68株后代材料均可扩增出多态性带。因此,BE444859/HaeIII可以作为粗穗披碱草蛋白质二硫键异构酶基因CAPS标记,用于检测小麦背景中的1Ht S染色体。本研究揭示当杂交亲本间无直接PCR多态性而又需要建立标记时,发展CAPS标记是行之有效的方法。

小麦蛋白质二硫键异构酶基因的克隆、表达及重组酶性质

目的:克隆小麦蛋白质二硫键异构酶(wheat protein disulfide isomerase,wPDI)基因,实现其在大肠杆菌中的表达并探究其酶学性质。方法:以小麦种子总RNA为模板,逆转录并扩增得到wpdi,并以pET-30b为表达载体、大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌进行原核表达,表达产物经金属螯合层析纯化后进行了酶学性质研究。结果:克隆的基因全长1 548 bp,与"Wyuna"品种小麦wpdi基因相似性达99%。构建了pET-30b-wpdi表达载体,获得w PDI的最佳表达条件为:诱导温度22℃,诱导时间6 h,诱导剂浓度0.5 mmol/L。该酶含4个硫氧还蛋白结构域,分子质量约为66.2 kD,具有二硫键的还原酶和异构酶活性以及分子伴侣活性。结论:对重组wPDI的表达和酶学性质研究,为wPDI在面制品加工及其他方面的应用提供参考依据。

大麦蛋白质二硫键异构酶基因家族的鉴定与表达分析

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerases,PDIs)是定位于真核生物内质网中的一类蛋白,具有催化蛋白质二硫键氧化还原反应与协助蛋白质发生构型变化、类似分子伴侣的功能,参与生长发育、生物或非生物胁迫应答等方面的调控。真核生物中PDI基因家族的分子鉴定已有报道,但是对大麦PDI基因家族的鉴定分析鲜有报道。本研究利用生物信息学分析手段鉴定了10个大麦PDI-Like基因(HvPDILs),并分析了相应编码蛋白的结构特征。与其他物种PDILs的系统发育分析发现,10个大麦PDILs分处在8个不同的系统分支,与小麦PDILs高度同源。对公共数据库中的组织和时空表达数据分析发现,HvPDILs基因均表达,且具组织和时空表达特异性。对接种大麦温性花叶病毒(BaMMV)之后的叶片样品进行基因表达水平分析,发现其中5个HvPDILs 基因出现显著的表达差异,说明其参与病毒感染过程,但参与方式及作用机制还有待后续研究。

蛋白质二硫键异构酶结构与相关疾病研究进展

蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI)属于硫氧还蛋白家族,其分子质量为57 kD,主要存在于内质网中,且结构中有两个活性位点,在蛋白质折叠过程中催化二硫键的裂解、形成和重排。PDI活性异常会导致未折叠或错误蛋白的积累,引起内质网应激(ERs),从而导致未折叠蛋白反应(UPR)。研究表明:PDI与癌症、神经紊乱等疾病显著相关,PDI的表达水平升高与多种癌症的发生、发展相关。通过对PDI的蛋白结构、功能、活性检测及相关疾病进行综述,以期为PDI及其病理研究提供新思路。

人蛋白质二硫键异构酶cDNA基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人胚胎肝组织中分离纯化出总ＲＮＡ，在总ＲＮＡ中提取ｍＲＮＡ，经逆转录得到ｃＤＮＡ第一条链，并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物，进行ＰＣＲ合成人蛋白质二硫键异构酶（Ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＤＩ）ｃＤＮＡ基因，将所得ｃＤＮＡ克隆到质粒ｐＵＣ１８上，转化大肠杆菌ＤＨ５α细胞，进行诱导表达筛选和活性筛选。将筛选的基因克隆到载体ｐＢＶ２２０上，在大肠杆菌细胞中表达，产物以溶解形式在胞浆中表达。表达产物经硫酸铵分级沉淀和ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ柱层析分离，产物的纯度与活性分别为９０％、１１００ｕ／ｇ。

玉米蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因的特征和表达(英文)

蛋白质二硫键异构酶(PDI)对蛋白的折叠和二硫键的形成起重要的作用.此外,PDI还执行许多其他的生物功能,是1个多功能酶.本文通过研究玉米中1个PDI基因的特征和表达,探讨它的功能作用.玉米中的PDI基因编码513个氨基酸.同源分析表明,该基因和水稻、小麦的PDI基因聚为一类,有很高的蛋白相似性.蛋白结构分析表明,该基因具有明显的PDI基因的结构特点,包括硫氧还蛋白活性位点(CGHC)以及内质网定位信号(KDEL).Northern杂交分析显示,该基因在发育种子的表达量高,同时受干旱、冷、ABA和盐等逆境胁迫诱导表达.PDI与GFP融合表达研究基因的亚细胞定位,表明该基因定位在除细胞膜外的细胞质和细胞器上.

蛋白质二硫键异构酶A3在消化系统肿瘤中的研究进展

目前恶性肿瘤已经成为威胁人类身体健康的主要疾病之一,致死率、致残率在逐年上升。蛋白质二硫异构酶A3(PDIA3)是PDI家族中重要的一员,是一种功能广泛的硫醇氧化还原酶,其在多种肿瘤中的表达含量升高,与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。尽管大量研究表明,PDIA3在许多肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用,但目前尚无系统的报道PIDA3在消化系统肿瘤中的作用。因此,该文综述了PDIA3在4种消化系统肿瘤中的不同表达情况及临床意义,探讨其在不同癌症发展阶段或临床预后中的作用,进一步寻找有效的早期诊断和基因治疗的潜在靶点。这对提高肿瘤患者的生存率具有十分重要的意义。

分泌型蛋白质二硫键异构酶在肿瘤发生发展中的研究进展

蛋白质二硫键异构酶(PDIs)家族是一组主要定位在内质网的巯基二硫键氧化还原酶,PDIs参与蛋白质二硫键的形成、还原和异构化,在维持蛋白质结构稳定和内质网稳态中发挥重要作用。PDIs蛋白在细胞中除可定位于内质网中,还可分泌至细胞外,存在于细胞外基质以及循环血液中。PDIs可以由肿瘤细胞或者其他细胞直接分泌至肿瘤微环境中,影响肿瘤细胞的增殖和迁移。本文就分泌型PDIs的结构功能及其与肿瘤发生发展之间的关系进行综述。

羽衣甘蓝类蛋白质二硫键异构酶PDIL1-2的基因克隆及蛋白表达分析

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)为试材,利用RT-PCR和RACE的方法从柱头中分离类蛋白质二硫键异构酶BoPDIL1-2基因。将BoPDIL1-2编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到大肠杆菌中进行原核表达与纯化;用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备BoPDIL1-2多克隆抗体;通过免疫印迹法检测BoPDIL1-2在不同组织及不同发育阶段柱头的表达情况。氨基酸序列比对分析结果显示,羽衣甘蓝BoPDIL1-2与油菜BnPDIL1-2、拟南芥AtPDIL1-2的一致性分别是97.3%和85.5%。SDS-PAGE结果显示,在分子量58 kD处有BoPDIL1-2蛋白特异性地诱导表达。免疫印迹结果显示BoPDIL1-2在羽衣甘蓝柱头中特异表达,而且在柱头发育早期表达量较低,在开花期柱头表达量较高。

刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆及原核表达

目的克隆刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)基因,原核表达、纯化重组TgPDI蛋白,并分析其免疫反应性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgPDI基因全长编码序列(登录号为AJ306291.2)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切并测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗His抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白及其免疫反应性;重组蛋白His-TgPDI通过Ni2+琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDSPAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度。结果 RT-PCR扩增产物约为1 427 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得约57 kDa的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的重组蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。亲和纯化后获得纯度大于95%的重组TgPDI蛋白质。结论克隆得到弓形虫PDI基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白,且该重组蛋白具有免疫反应性。

沟叶结缕草蛋白质二硫键异构酶(ZmPDIs)基因家族耐盐功能分析

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)及其类蛋白,是硫氧还蛋白超家族的重要成员,具有分子伴侣活性及钙离子结合位点,负责催化蛋白质二硫键的氧化、还原和异构。本研究从沟叶结缕草基因组中鉴定获得了5个蛋白质二硫键异构酶(ZmPDIs)基因,对其进行了系统进化与基因结构的生物信息学分析,利用同源基因缺失酵母突变体对其耐盐功能进行了初步分析。荧光定量RT-PCR结果表明5个ZmPDIs基因的表达均受到盐胁迫的诱导。这些结果为进一步研究ZmPDIs的耐盐生理功能及分子机制提供参重要参考。

蛋白质二硫键异构酶家族的结构与功能

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族是一类在内质网中起作用的巯基-二硫键氧化还原酶.它们通常含有CXXC(Cys-Xaa-Xaa-Cys,CXXC)活性位点,活性位点的两个半胱氨酸残基可催化底物二硫键的形成、异构及还原.所有PDI家族成员包含至少一个约100个氨基酸残基的硫氧还蛋白同源结构域.PDI家族的主要职能是催化内质网中新生肽链的氧化折叠,另外在内质网相关的蛋白质降解途径(ERAD)、蛋白质转运、钙稳态、抗原提呈及病毒入侵等方面也起重要作用.

紫花苜蓿蛋白质二硫键异构酶mPDI的生物信息学分析与同源建模

紫花苜蓿蛋白质二硫键异构酶的基因已经被克隆测序。利用其mRNA及氨基酸序列,应用生物信息学软件预测了该蛋白质的理化性质、亲/疏水性、信号肽、二级结构、卷曲螺旋结构、跨膜区域、糖基化位点、活性位点、亚细胞定位、功能结构域及高级结构。结果表明,该蛋白质是一个整体疏水性蛋白,细胞定位为粗面内质网,含有512个氨基酸,理论等电点为4.98,信号肽位于1～24号氨基酸;二级结构中α-螺旋占26.37%(135AA),无规则卷曲占53.32%(273AA),延伸链占20.31%(104AA);包含3个卷曲螺旋结构,3个糖基化位点,2个硫氧还蛋白结构域,2个硫氧还蛋白活性位点。Ramachandram结构检测表明此模型的三维结构符合立体化学能量规则。

海南产桶形芋螺蛋白质二硫键异构酶的鉴定

蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶.在热带药用海洋生物芋螺的毒液中富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要.本研究主要采用凝胶过滤层析和制备型Rotofor液相等电聚焦电泳等多种方法,从海南产桶形芋螺(Conus betulinusLinnaeus)毒管中分离纯化天然的PDI酶蛋白,经电泳和MALDI-TOF MS质谱鉴定分析确证获得了高纯度的桶形芋螺PDI酶,建立了天然芋螺PDI酶分离纯化的技术方法.以芋螺毒素线性肽K412为底物进行了PDI酶活性鉴定.结果表明,该分离纯化的PDI酶能够促进K412的氧化折叠.由于芋螺毒素的氧化折叠非常复杂,且氧化折叠后具有正确二硫键连接方式的芋螺毒素才具有各种药理活性,因此,本研究结果为后续PDI酶在种类繁多的芋螺毒素氧化折叠中的应用及其作用机制研究提供了重要的物质基础.

紫花苜蓿蛋白质二硫键异构酶mPDI的生物信息学分析与同源建模研究(英文)

利用紫花苜蓿蛋白质二硫键异构酶(mPDI)的mRNA(来自NCBI,登录号为Z11499.1)及氨基酸序列(来自UniProtKB/Swiss-Prot数据库及NCBI数据库,其登录号分别为P29828、CAA77575.1),应用生物信息学软件预测了该蛋白质的理化性质、亲疏水性、信号肽、二级结构、卷曲螺旋结构、跨膜区域、糖基化位点、活性位点、亚细胞定位、功能结构域及高级结构。结果表明:紫花苜蓿mPDI蛋白质是一个整体疏水性蛋白,细胞定位为粗面内质网,含有512个氨基酸,理论等电点为4.98,分子量为57087.4Da,原子组成为C2597H3977N651O786S6,摩尔消光系数在280nm处为37610,不稳定系数为40.12,脂肪系数为79.96,总平均亲水性为-0.357。该蛋白质由20种氨基酸组成,其中非极性R基团氨基酸占44.3%,极性R基团氨基酸占28.4%,酸性氨基酸占13.6%,碱性氨基酸占13.1%,Lys、Glu、Val、Ala含量最为丰富,Met和Cys含量最少。信号肽位于1～24号氨基酸。利用ProtScale软件的KyteandDoolittle算法对mPDI蛋白进行亲/疏水性预测,结果表明该蛋白质含有7个高疏水性区域,分别分布在40～50区域、95～105区域、120～130区域、190～200区域、285～295区域、340～350区域以及365～375区域。利用SignalP网络工具对mPDI蛋白进行信号肽的预测,神经网络法显示第24～25位点是最可能的剪切点,马可夫模型显示了同样的信号肽酶切位点。mPDI蛋白质二级结构中α-螺旋占26.37%(135AA)、无规则卷曲占53.32%(273AA)、延伸链占20.31%(104AA);包含3个卷曲螺旋结构、3个糖基化位点(分别为143位的S、148位的T、461位的S)、2个硫氧还蛋白结构域(14～144位、357～485位)、2个硫氧还蛋白活性位点(54～72位、399～417位)、1个内质网靶向序列(509～512位);Ramachandram结构检测表明此模型的三维结构符合立体化学能量规则。

蛋白质二硫键异构酶在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达及意义

目的：了解蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)在幽门螺杆菌(H pylon)感染人胃黏膜组织中的表达情况．方法：分别应用半定量RT-PCR方法及Westem blot方法检测感染(n=32)与未感染(n=28)H pylori的人胃黏膜组织中PDI mRNA及蛋白的表达情况．结果：未感染组PDI mRNA及蛋白表达量分别为0．5704±0．0794,0．5198±0．0379,感染组PDI mRNA及蛋白表达量分别为1．0642±0．1533,0．8252±0．0321：两组相比差异显著(P＜0．01)．结论：正常情况下胃黏膜组织有PDI mRNA的表达及蛋白的合成,H pylori感染可使胃黏膜增加PDI mRNA的表达及蛋白的合成．

桶形芋螺毒液蛋白质组分析及二硫键异构酶的鉴定

蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶。在热带药用海洋生物芋螺的毒液中,富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要。研究上样量、水化方式与时间、除盐步骤、聚焦电压和时间、平衡时间、凝胶电泳方法和染色方法等方面,优化并建立了较为理想的芋螺毒液蛋白样品双向电泳的实验条件与方法;通过双向电泳和MALDI-TOF-MS质谱分析技术,从海南产桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)毒液蛋白中成功分离鉴定出PDI等9种蛋白;通过双向电泳和PDQuest软件分析了并比较了三种不同大小桶形芋螺毒液总蛋白的差异性,并质谱鉴定出5个明显的差异蛋白点。研究建立了桶形芋螺毒液蛋白双向电泳分析及质谱鉴定的技术方法,为后续大量分离纯化出天然的芋螺PDI酶以及利用蛋白质组学技术方法深入研究芋螺毒液特征提供了重要的基础。

微小RNA-15a-5p靶向蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的探讨微小RNA-15a-5p(miR-15a-5p)是否可通过靶向蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白(PDIA6)而抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭。方法选取2018年2月至2019年3月江南大学附属医院接受治疗的前列腺癌病人50例,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与蛋白印迹法(Western blotting)分别检测前列腺癌组织、癌旁组织中miR-15a-5p、PDIA6的表达量;体外培养人前列腺癌DU145细胞,将细胞分为miR-NC组、miR-15a-5p组、si-NC组、si-PDIA6组、miR-15a-5p+pcDNA组、miR15a-5p+pcDNA-PDIA6组;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖;Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验验证miR-15a-5p、PDIA6的靶向关系。结果与癌旁组织相比,前列腺癌组织中miR-15a-5p的表达水平降低[(1.00±0.17)比(0.68±0.11)],PDIA6 mRNA[(0.99±0.09)比(1.64±0.18)]和蛋白[(0.44±0.07)比(0.76±0.17)]表达水平升高;转染miR-15a-5p mimics或转染si-PDIA6可降低细胞存活率(P<0.05),减少迁移及侵袭细胞数(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-15a-5p可靶向结合PDIA6;PDIA6过表达可降低miR-15a-5p过表达对DU145细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论过表达miR-15a-5p通过降低PDIA6的表达对列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力有抑制作用。

结构域对小麦蛋白质二硫键异构酶性质的影响

小麦蛋白质二硫键异构酶(wPDI)由4个硫氧还蛋白结构域a-b-b'-a'和C-末端c尾组成.为考察wPDI各结构域对活性的影响,通过亚克隆表达了8个不同结构域组成的wPDI截短蛋白,表达产物经分离纯化后进行了酶学性质研究和蛋白质电泳分析.结果表明,所设计的8个wPDI截短蛋白在大肠杆菌BL21中得到了表达,金属螯合亲和层析和分子排阻层析后获得了纯度较高的wPDI截短蛋白;活性测定结果表明,wPDI的所有结构域对其二硫键氧化还原活性和分子伴侣活性都有贡献,c尾缺失不影响其异构活性,但提供了分子伴侣活性的关键氨基酸结合位点;对截短蛋白A和A'的电泳分析发现,wPDI的a结构域活性位点主要以氧化态为主,而a'结构域主要以还原态为主.研究结果为深入理解wPDI的功能性质奠定了基础.

蛋白质二硫键异构酶的生物学功能研究进展

蛋白质二硫键异构酶由多种细胞分泌,在生物学代谢过程中具有重要作用,其与糖尿病缺血性心脏病、脑缺血性疾病、血栓性疾病、阿尔茨海默病、白血病、肿瘤等多种疾病的发生发展机制密切相关,现针对蛋白质二硫键异构酶的定义、功能及与相关疾病的关系做一论述。