基于原子转移自由基聚合反应的高灵敏度蛋白质印迹方法研究

目的探索基于金纳米颗粒(AuNPs)和原子转移自由基聚合反应(ATRP)的蛋白质印迹高灵敏度检测方法。方法将AuNPs通过ATRP附着到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,通过PVDF膜对小分子的吸附作用,提高检测灵敏度。结果改进后的PVDF膜(PVDF-ATRP-AuNPs)对目标小分子的截留效率提高了80%左右,检测限显著降低。结论改进后的方法具有良好的稳定性、优异的灵敏度,能对超低浓度小分子待测物进行有效检测。

酶联免疫吸附法与蛋白质免疫印迹法检测抗核小体抗体在SLE诊断中的价值对比

目的比较蛋白质免疫印迹法(WB)、酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗核小体抗体(AnuA)在系统性红斑狼疮(SLE)诊断中的价值。方法306例自身免疫疾病患者,根据明确的临床诊断结果将患者分为SLE组(SLE患者,144例)和非SLE组(非SLE患者,162例);选取同期非自身免疫疾病患者100例作为对照组。所有研究对象均采用ELISA及WB检测AnuA。分别统计两种检测方法的AnuA检测结果。比较两种检测方法对AnuA的诊断价值,包括准确度、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值,并进行统计学检验,分析两种检测方法的一致性。结果SLE组:ELISA检测AnuA阳性120例、阴性24例,WB检测AnuA阳性109例、阴性35例;非SLE组:ELISA检测AnuA阳性76例、阴性86例,WB检测AnuA阳性71例、阴性91例;对照组:ELISA检测AnuA阳性17例、阴性83例,WB检测AnuA阳性11例、阴性89例;两种检测方法在SLE组、非SLE组和对照组的AnuA检测阳性率比较无统计学意义(P>0.05);但两种检测方法的SLE组患者AnuA阳性率明显高于非SLE组和对照组,且非SLE组患者AnuA阳性率明显高于对照组(P<0.05)。ELISA检测AnuA的敏感度87.4%(180/206)高于WB检测的80.1%(165/206)(P<0.05);两种检测方法的特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度比较无统计学意义(P>0.05)。两种检测方法检测结果的总符合率为90.1%,判断具有较好的一致性(K值=0.516)。结论ELISA及WB检测AnuA在SLE中均具有较高的诊断效能,临床可在AnuA初步检测中运用WB,如有必要可在复检中运用ELISA,有效提高检测阳性率,为临床诊断SLE提供参考。

间接免疫荧光法及蛋白质印迹法对肺癌患者体内自身抗体的分析

目的：了解肺癌患者血清自身抗体阳性率、细胞内定位及荧光图形特点，探索自身抗体作为肿瘤标志物的可能性。方法：应用间接免疫荧光法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＩＩＦ）检测 ７７份肺癌以及 １４０份不同年龄段正常人血清中自身抗体。提取人喉癌上皮细胞（Ｈｅｐ－２）蛋白抗原，采用蛋白质印迹法对８１份肺癌患者及５２份正常人血清进行分析。结果：肺癌组和对照组的自身抗体阳性率有显著差别，两组人群的自身抗体阳性率皆随年龄增长而增高（Ｐ＜０．０５），在不同年龄段，肺癌组皆显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）。肺癌组和对照组在自身抗体荧光图形、靶抗原细胞内定位上均有明显不同。７４份肺癌患者血清中检测到阳性条带（７４／８１，９１．４％），显著高于对照组（３１／５２，６１．５％），其中大多数与自身免疫性疾病中常见的自身抗体不同，并发现８２．７％（６７／８１）的肺癌患者具有针对相对分子质量初步鉴定为６．５万的靶抗原的阳性条带，该条带仅在２２．２％（１２／５２）的正常人中查及。结论：肺癌患者血清的自身抗体谱与正常人生理性自身抗体谱及自身免疫性疾病中的自身抗体谱不同，进一步研究其靶抗原本质及其生物学意义。

光接枝表面修饰法制备温敏型蛋白质分子印迹微球

本研究采用一种新颖简便的方法在水相中成功制备了溶菌酶（Lysozyme）温敏型分子印迹微球。首先将二乙基二硫代氨基甲酸钠（引发转移终止剂Iniferter）修饰到介孔氯甲基聚苯乙烯微球（MPCbeads）上，然后以修饰有Iniferter的介孔氯甲基聚苯乙烯微球（modified MPCbeads）作为载体，

蛋白质印迹法检测GIRK4在SD大鼠肾脏组织的表达

目的探讨GIRK4基因在健康SD大鼠肾脏组织的表达水平。方法采用蛋白质印迹法(Western-blot-ting)对健康SD大鼠肾脏组织GIRK4蛋白表达进行定量分析。结果 GIRK4基因蛋白在健康SD大鼠肾脏组织相对表达量为3.37±0.68。结论从蛋白质水平对GIRK4基因在健康SD大鼠肾脏组织表达的定量研究,将为探索GIRK4基因与肾脏生理功能及其相关临床疾病的关系奠定基础。

蛋白质印迹法检测小鼠不同器官中细胞色素C的含量

目的探讨细胞色素C在不同脏器中的差异。方法采用蛋白质印迹法(Western Blot)测定小鼠肝、肾、心中细胞色素C的含量。结果细胞色素C含量在肝组织中最高,心肌组织中最低。结论细胞色素C含量具有组织器官差异性。

用于免疫印迹法的生物素化标准分子量蛋白质的制备

免疫印迹技术目前已被广泛应用。确定抗原分子量通常使用标准分子量蛋白平行电泳并转移至NC膜,切下相应条带用氨基黑等染料染色,不但费时,敏感性低,而且在染色和脱色时易引起NC膜的皱缩。1986年Della-Penna等报告用生物素化蛋白作为蛋白质印迹(Western blots)的分子量标准品。目前国外已有商品出售,但价格较贵。本文利用国产低分子量标准蛋白质和自制N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯制备生物素化蛋白取得满意结果。

包埋法蛋白质分子印迹的材料和洗脱方式

本文总结了蛋白质分子印迹技术中包埋法常用印迹材料的特点,及各种洗脱方式在分子印迹技术中的应用情况。引用文献63篇。

PBL结合翻转课堂教学法在蛋白质免疫印迹教学中的实践探索

学习蛋白质免疫印迹对培养医学生基础科研能力具有重要意义。本文探讨基于雨课堂智慧教学平台,PBL结合翻转课堂教学法在蛋白质免疫印迹实验教学中对提高学生自学能力、动手能力及科研能力的作用。

液相沉积法制备蛋白质印迹聚合物及吸附性能表征

本文采用液相沉积法制备蛋白质印迹聚合物,并对其形貌、吸附性能、特异性、选择性吸附进行表征。实验结果表明:用液相沉积法制备的蛋白质印迹聚合物具有规则球形形貌;通过与非印迹聚合物吸附性能的对比,结果表明蛋白质印迹聚合物具有较好的特异性、选择性吸附能力。以上实验结果说明液相沉积法是一种制备蛋白质印迹聚合物的良好方法。

间接免疫荧光法与蛋白质免疫印迹试验检测自身免疫性肝炎抗体的效果

目的分析采用间接免疫荧光法与蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测自身免疫性肝炎(AIH)抗体的效果。方法选择2017年2月—2018年6月云南省滇南中心医院(红河哈尼族彝族自治州第一人民医院)收治的231例肝炎患者作为研究对象,包括AIH组(33例)、病毒性肝炎组(136例)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)组(59例)和原发性硬化性胆管炎(PSC)组(3例);另选择同期63名健康体检者作为健康对照组。采用间接免疫荧光法检测AIH中抗核抗体(ANA),采用Western blotting检测抗线粒体抗体M2(AMA-M2)、抗肝/肾微粒体抗体Ⅰ型(LKM-1)、抗可溶性肝抗原抗体/肝胰抗原抗体(SLA/LP)、抗平滑肌抗体(ASMA)与抗肝细胞溶质抗原Ⅰ型抗体(LC-1)等。结果ANA在AIH组、PBC组、PSC组的阳性检出率明显高于病毒性肝炎组和健康对照组〔72.73%(24/33)、88.14%(52/59)、66.67%(2/3)比30.15%(41/136)、6.35%(4/63),均P<0.05〕;AIH组中LKM-1、LC-1、SLA/LP、ASMA的阳性率以及PBC组中AMA-M2的阳性率均明显高于病毒性肝炎组和健康对照组〔LKM-1:15.15%(5/33)比0.74%(1/136)、0.00%(0/63),LC-1:9.09%(3/33)比0.00%(0/136)、0.00%(0/63),SLA/LP:3.03%(1/33)比0.00%(0/136)、0.00%(0/63),ASMA:57.58%(19/33)比0.74%(1/136)、0.00%(0/63),AMA-M2:93.22%(55/59)比4.41%(6/136)、0.00%(0/63),均P<0.05〕。结论临床上针对AIH抗体采用间接免疫荧光法联合Western blotting检测,具有较高的诊断效率,值得推广应用。

Western blot方法中不同电流强度对较大分子蛋白质转膜效率的影响

目的研究Western blot方法中不同电流强度对较大分子蛋白质转膜效率的影响。方法利用(36～250)×103标志蛋白质,以8%SDS-PAGE凝胶分离,然后分别以100、200、300、400、500mA恒流湿法电转2h。结果 100、200mA恒流2h不能使250×103较大分子蛋白质全部转膜,凝胶有残留。300mA以上则可使大部分或全部转膜,胶上未见残留。结论电流强度对较大蛋白质转膜有影响。300～400mA可作为250×103左右较大分子蛋白质从8%SDS-PAGE凝胶转膜的最佳恒流强度。

蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用

氟是机体必需的微量元素,如果体内氟蓄积增多,可以引起氟中毒。蛋白质印迹法是生物医学科研中鉴定目的蛋白表达的常用手段,本文对蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用进行介绍。

用双向电泳及蛋白质印迹技术筛选乳腺癌相关抗原

目的:应用双向电泳及免疫印迹技术分析乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,寻找乳腺癌相关抗原。方法:提取乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,双向电泳技术(2-DE)对总蛋白进行分离后转膜,将健康人血清(对照组)和乳腺癌患者血清(实验组)作为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析,寻找杂交蛋白点的差异。结果:MCF-7总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱共检测到248个蛋白质斑点,Western blotting显示实验组抗原抗体反应点23个,对照组为13个,找到10个差异蛋白点。结论:乳腺癌患者血清中的抗体表达水平有改变,这10个差异蛋白点有可能是乳腺癌相关抗原。

γ射线诱发的白血病小鼠胸腺细胞蛋白质酪氨酸磷酸化水平的变化

目的 :探讨γ射线体外诱发的白血病小鼠胸腺细胞总蛋白质酪氨酸磷酸化水平的变化。方法 :35 3只 BAL B/ c小鼠分为照射组及对照组 ,照射组经 6 0 Coγ射线全身照射后 ,病理证实出现白血病者为癌变组 ,未出现任何肿瘤者为未癌变组 ;对照组为正常 BAL B/ c小鼠 ,未经γ射线照射 ,与照射组同步喂养。分离胸腺细胞 ,应用免疫沉淀法及 Western印迹分析检测蛋白质酪氨酸磷酸化水平。 结果 :癌变组胸腺细胞中蛋白质酪氨酸磷酸化水平总体上明显高于对照组及未癌变组 ,尤以相对分子质量 (4 7.5～ 83)× 10 3及 32 .5× 10 3附近蛋白变化最为明显 ;相对分子质量为 35× 10 3的蛋白在癌变组中酪氨酸磷酸化明显 ,而在对照组及未癌变组中未检测到磷酸化的发生。 结论

RNAi介导的Bip表达下调促进基于蛋白质剪接的双链共转基因细胞分泌FⅤⅢ凝血活性

目的探讨用RNA干扰技术下调内质网蛋白伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的表达,对基于蛋白质剪接的双链共转凝血因子ⅤⅢ(FⅤⅢ)基因HEK293细胞分泌剪接FⅤⅢ蛋白的量和活性的影响。方法以培养的HEK293细胞,用含蛋白内含子的B区缺失型FⅤⅢ(BDD-FⅤⅢ)的重链和轻链基因表达载体共转染经Bip-siRNA处理的细胞,免疫印迹法检测Bip的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长,用酶联免疫吸附(ELISA)和发色分析法分析转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ蛋白量和活性。结果 RNA干扰下调Bip表达作用明显,细胞生长不受影响;Bip下调的共转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ和重链量分别为(142±33)μg/L和(197±43)μg/L,明显高于对照细胞[分别为(89±23)μg/L和(120±27)μg/L];Bip下调的共转基因细胞分泌的FⅤⅢ凝血活性为(1 050±160)IU/L,明显高于对照细胞[640±170(IU/L)]。结论 Bip表达下调通过促进剪接BDD-FⅤⅢ的分泌可有效提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅤⅢ基因功效,为进一步动物体内实验提供了依据。

化学发光技术在蛋白质组学研究中的应用

目的:探讨在蛋白质组学研究中应用化学发光技术分析鉴定蛋白质的方法和价值。方法:采用细胞培养、双向电泳及银染等技术建立小鼠神经元蛋白质组图谱,再用PDQuest 2D分析软件和免疫印迹持久性化学发光技术选择性地鉴定三种小鼠神经元蛋白质-PI3Kr3、MEK1、PKCα。结果:三种蛋白质的双向电泳化学发光图谱上均只出现了1个特异蛋白质斑点,信号强,背景低。结论:利用化学发光技术鉴定蛋白质简单、实用、灵敏、高效,可为蛋白质组学的研究提供有力的技术支持。

PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定

为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法。首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响。利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定。菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功.PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6。经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白。SDS-PAGE电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致。作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法。