肝癌细胞株HepG2的G1期细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

采用双向电泳分离肝癌细胞株HepG2的G1期细胞的蛋白质,经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析显示:在pH3—10,13cm的IPG胶条上,可分离到227个重复性及分辨率均较好的蛋白斑点,蛋白斑点的匹配率为84%。建立了HepG2的G1期细胞蛋白质组双向电泳图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。

适用于黄麻根部蛋白质组学分析的双向电泳技术

以黄麻品种‘9511’幼苗为试验材料,研究其根部蛋白提取方法的得率及不同的蛋白样品溶解方法、电泳上样量和IPG胶条pH范围对双向电泳图谱的影响。结果表明：采用三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法提取黄麻根部蛋白质,蛋白得率为80 mg/g;蛋白粉末溶解采用两次水化法,裂解液中含有7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、65 mmol/L DTT、0.2%载体两性电解质和1 mmol/L PMSF,能够较充分地溶解蛋白质,且制备的样品浓度能够满足双向电泳上样要求;上样量为400μg时得到的图谱分辨率高、蛋白斑点分布均匀、清晰;等电聚焦（Iso-electrofocusing,IEF）采用pH 4-7、17 cm的IPG胶条时所得图谱质量最佳。研究表明,样品的制备及IEF有效除盐对获得理想的2-DE图谱非常关键;取材、染色等细节对2-DE的重复性影响很大。

应用优化的双向电泳技术建立纤维堆囊菌So0157-2蛋白质组数据库(英文)

堆囊菌丰富的次级代谢产物是新药的重要来源,而蛋白质组学分析是研究代谢调控的有效方法.然而堆囊菌含有大量的胞外多糖以及黏液,干扰了蛋白质组学分析中蛋白质的溶解度、分辨率及重现性.为了高通量地筛选Sorangium cellulosumSo0157-2表达的特异性蛋白,实验优化了S.cellulosum So0157-2双向电泳方法.首先,S.cellulosum So0157-2蛋白在裂解液中有更好的溶解度.pH 3～10非线性胶条和1 mg的蛋白上样量适用于第一向等电聚焦,分别提高了蛋白质点的分辨率和低丰度蛋白质的表达.15%SDS-PAGE改善了S.cellulosum So0157-2蛋白分离的分辨率和重现性.最终,通过优化的双向电泳方法获得了S.cellulosum So0157-2在M26培养基中培养3天的全蛋白质表达谱,并检测到552个蛋白质点.进而对表达蛋白通过MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定,其中474个蛋白质得到鉴定,鉴定率85.9%.得到鉴定的蛋白质包括细胞结构和功能组分,以及细胞代谢合成酶类,其中8个蛋白质与糖类的转化和代谢相关,这有助于糖基化埃博霉素A的深入研究.该优化方法为进一步建立纤维堆囊菌So0157-2在各种培养条件下的蛋白质组表达数据库打下基础.

烟草叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

以烟草品种K326旺长后期叶片为材料,用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对5种蛋白质提取方法(TCA/丙酮沉淀法、Mg/NP-40法、苯酚法、TCA-苯酚法和可溶性蛋白质提取法)进行比较,并对自制管胶pH范围进行探索。结果表明:苯酚法图谱中蛋白质条带最多、最清晰,并可获得较高纯蛋白质得率,为0.0420%,且图谱中蛋白质条带数最多、最清晰。自制管胶pH范围优化试验结果表明,以两性电解质pH 3-10与pH 5-8比例为1:3的2-DE图谱质量最佳,蛋白质可得到较好的分离。

石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质表达的双向电泳分析

【目的】石榴果实色泽是影响果品商品价值的重要因素之一,但石榴果皮颜色形成的分子机制还不清楚。应用差异蛋白组学技术,从蛋白水平上探究石榴果实发育成熟期果皮的代谢进程。【方法】运用双向电泳和MALDI-TOFTOF MS质谱鉴定技术研究‘三白’石榴和‘中农红’石榴果实成熟时果皮蛋白质组学差异。【结果】分别对‘三白’、‘中农红’石榴进行2-DE和质谱鉴定,在‘三白’和‘中农红’石榴果皮的电泳图谱中发现每一张重复胶上分别可以检测到892个蛋白点和890个蛋白点,与‘中农红’相比,在‘三白’果皮图谱中共检测到36个表达量相差2倍以上的蛋白质点,相对于‘中农红’,‘三白’有13个蛋白质点上调表达,19个蛋白质点下调表达。通过质谱鉴定和数据库检索注释了4个蛋白质点。分别为半胱氨酸合酶1(sport 1402)、细胞色素b6-f复合体(sport 0013)、叶绿素a/b结合蛋白(sport 5108)及果糖激酶2-like(sport 0503)。【结论】细胞色素b6-f复合体(sport 0013)、叶绿素a/b结合蛋白(sport 5108)和果糖激酶2-like(sport 0503)可能与果皮颜色变化相关;半胱氨酸合酶1(sport 1402)可能对提高石榴的抗氧化胁迫能力起到了重要作用。为研究石榴果实发育蛋白质组学及改善石榴果实品质提供一定的理论依据。

缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导处理 1、3、5d后 ,用酚法和TCA 丙酮法提取叶的可溶性蛋白 ,进行双向电泳 (2 DE)分析 .结果显示 :(1 )三种缺铁胁迫的可溶性蛋白 ,在不同的pH范围中 2 DE图谱上的比较 .使用pH3～ 1 0宽范围、线性 (L)的IPG胶条 ,经电泳分离后利用Z3图象分析软件 ,可在SDS PAGE凝胶上检测到 4 5 0个左右的蛋白点 ,酸性蛋白占 89% .选用pH4～ 7窄范围、线性 (L)的IPG胶条 ,经电泳后可在SDS PAGE凝胶上检测到 6 0 0个左右的蛋白点 ,其中缺铁诱导上调表达的有 2 9个点 ,减弱表达的有 1个点 ,诱导特异表达的有 5个点 .(2 )不同方法提取可溶性蛋白的差异 .酚法提取的蛋白再溶性好 ,纯度较高 .TCA 丙酮法简单易操作 ,蛋白损耗少 ,在 2 DE图象上 ,碱性端显示的蛋白点较多 ,但此法的缺点是再溶性差 ,对 2

大豆种子萌发中蛋白质组成的双向电泳分析

采用双向电泳技术分析了大豆种子萌发时期蛋白质的差异表达。研究发现,在考染胶上,通过PDQuest分析,在成熟干种子和萌发种子的2-DE图谱上分别获得341和376个蛋白斑点,两个时期的2-DE图谱非常相近,说明绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未开始降解。有21个蛋白点在萌发的大豆种子中表达量上调,9个表达量下调。对这些蛋白的进一步鉴定将有助于深入理解大豆种子萌发过程的生理及分子机制。

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

【目的】建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳（2-DE）技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础。【方法】对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条p H范围等关键步骤进行优化。【结果】采用三氯乙酸/丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl（p H 8.0）裂解缓冲液,上样量为100 mg,以p H 4~7、18 cm的IPG胶条在12%SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱。【结论】建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持。

双向电泳和肽质量指纹谱技术鉴定支气管上皮细胞恶性转化相关蛋白质ANX1-human

采用 2 - D PAGE及质谱技术对α粒子照射诱发人支气管上皮恶性转化细胞的不同阶段进行了比较蛋白组分析与鉴定 .2 - D电泳后在分子量 1 4.4～ 94k D,等电点 3～ 1 0范围内分离出约 1 1 0 0个不同蛋白质斑点 .对等电点约 7,分子量约 40 k D的蛋白质点进行了质谱分析 .鉴定出分子量为38.58k D、等电点 6.64的蛋白质 ANX1 - human(脂皮质蛋白 ,lipocortin ) ,并且发现该蛋白质在BEP2 D细胞恶性转化过程的不同时期存在差异表达 .提示蛋白质 ANX1 - human参与了支气管上皮细胞恶性转化过程 ,与细胞恶性转化相关 .

镉胁迫下三个萝卜栽培种蛋白质变化的双向电泳比较研究(英文)

在0.5mmol·L-1Cd2+处理时,小五缨(XWY)的发芽率下降至92%,并且随着Cd2+浓度的增加,发芽率逐渐降低,在1和5mmol·L-1Cd2+浓度处理时,发芽率分别降至83%和67%。象牙白(XYB)则在5mmol·L-1Cd2+浓度时,发芽率下降。卫青(WQ)在0.05mmol·L-1Cd2+浓度时,发芽率已降至83%,1和5mmol·L-1时则下降至58%。幼苗生长也明显受Cd2+处理影响,在0.05mmol·L-1Cd2+处理时,3种栽培萝卜的幼苗生长均受到明显影响,并且随Cd2+浓度的增加,生长受抑加重。从发芽率和幼苗生长两种实验结果看,卫青对Cd2+最为敏感。双向电泳结果表明,Cd2+处理后3种栽培萝卜幼苗中蛋白质组分有明显变化。小五缨中,0.1mmol·L-1Cd2+处理后,有5个蛋白质点消失,15个新的蛋白质点被诱导产生。象牙白中,2个蛋白质点消失,1个蛋白质点含量减少,13个新的蛋白质点被诱导产生。卫青中,12个新的蛋白质点诱导产生,但没有发现蛋白质点消失现象。Cd2+处理后,3种栽培萝卜中,蛋白质合成的变化与幼苗生长受抑存在明显相关性,这一实验结果对于探讨萝卜Cd2+害的生化机理是有重要意义的。

豌豆白化苗蛋白质双向电泳技术的建立

以豌豆白化苗为试验材料,分析了不同的蛋白质提取时间(4 h、8 h及过夜)和蛋白质上样量(500、1 000、2 000μg)对双向电泳蛋白质得率和等电聚焦效果的影响。结果表明,不同的蛋白提取时间和蛋白上样量对等电聚焦效果影响较大。适宜的豌豆白化苗提取时间应至少长于8 h,最好提取过夜,能裂解得到大量蛋白质;适宜的豌豆白化苗蛋白上样量为1 000μg,此条件下,双向电泳的分辨率最高,分离出的蛋白大多为小分子量功能性蛋白。

双向电泳法分析树舌多糖GF对小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白质组表达的影响

目的:探明树舌多糖(GAPS)GF对小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白质组表达的影响。方法:昆明种小鼠随机分为2组:肿瘤组和树舌多糖组,接种后各组肌肉注射给药,分别给与生理盐水和树舌多糖GF。连续10天,于末次给药24 h,处死小鼠,剥离肿瘤组织。应用2-DE技术检测各组小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白的表达。应用PDQuest软件分析电泳结果,找出差异表达的蛋白质点。根据近似等电点和分子量的数值进行数据库和文献综合检索,推测差异点的蛋白质身份。结果:肿瘤组共获得蛋白质点101个,树舌多糖组85个;其中54个蛋白点为肿瘤组特异表达,38个蛋白点为树舌多糖组特异表达;肿瘤组与树舌多糖组共表达的蛋白质点中,有14个点表达量相差两倍以上。第1098号斑点认为可能是抑癌基因PTEN的产物。结论:树舌多糖GF可以影响小鼠HepA瘤细胞多种可溶性蛋白的表达,这种影响很可能与树舌多糖GF的抗肿瘤机制有关;其抗肿瘤的作用靶点之一可能为抑癌基因PTEN。

蛋白质组学研究中双向电泳技术的应用

双向电泳技术(2-DE)是蛋白质组研究的核心技术。本文重点介绍了双向电泳的原理、实验操作过程中的具体步骤以及近年来在实验过程中发展的一些新方法和进展,并从一些方法的局限性和相关技术改进等方面做了简要综述,为进一步开发利用该技术提供参考依据。

人胃癌细胞环氧合酶-2表达的蛋白质组双向凝胶电泳分析

目的:建立和优化胃癌蛋白质组研究的方法系统,并分析人胃癌细胞SGC7901-asCOX2及SGC7901-pcDNA(用COX-2反义重组质粒及空载体分别转染胃癌细胞系SGC7901得到的两个细胞系)表达的蛋白质组,并建立二者之间的差异表达谱.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳分离SGC7901-asCOX2及SGC7901-pcDNA细胞总蛋白,银染显色,Melanie32-D软件分析两种细胞蛋白质组的表达差异.结果:获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱.图像分析发现6个蛋白点只在SGC7901-pcDNA细胞中检测到表达,4个点只在SGC7901-asCOX2细胞中检测到表达.与SGC7901-pcDNA细胞相比,在SGC7901-asCOX2细胞中有10个蛋白质点表达下调,6个蛋白点表达上调.结论:人胃癌细胞SGC7901-asCOX2及SGC7901pcDNA表达的蛋白质组有明显差异.

基于双向电泳技术研究湖羊初乳和常乳乳蛋白质组差异

试验旨在分析绵羊初乳和常乳乳蛋白质组的差异,揭示绵羊不同泌乳阶段的乳蛋白质组特征。选用6只胎次相同、预产期相近的湖羊母羊,分别采集分娩后第1、3、7天的初乳和第14、28、56天的常乳,每个时间点采集6份奶样并等体积混合,离心弃去乳脂肪,采用双向电泳(2-DE)技术对初乳和常乳的脱脂乳蛋白进行比较分析。结果发现,初乳中乳蛋白含量较高,且随着泌乳期的延伸,乳蛋白含量降低。以第1天乳蛋白2-DE图谱为参照,第3天检测到38个差异蛋白点,其中有20个蛋白点仅存在于第1天图谱中,有1个蛋白点仅存在于第3天图谱中,其余17个蛋白点呈现表达量的差异;第7天检测到35个差异蛋白点,其中有19个蛋白点仅存在于第1天图谱中,有1个蛋白点仅存在于第7天图谱中,其余15个蛋白点呈现表达量的差异;第14天检测到34个差异蛋白点,其中有11个蛋白点仅存在于第1天图谱中,有1个蛋白点仅存在于第14天图谱中,其余22个蛋白点呈现表达量的差异;第28天检测到38个差异蛋白点,其中有28个蛋白点仅存在于第1天图谱中,有1个蛋白点仅存在于第28天图谱中,其余9个蛋白点呈现表达量的差异;第56天检测到36个差异蛋白点,其中有26个蛋白点仅存在于第1天图谱中,有1个蛋白点仅存在于第56天图谱中,其余9个蛋白点呈现表达量的差异。综上,共检测出44个差异表达的蛋白点,其中有8个蛋白点仅存在于第1天图谱中,而这些蛋白主要涉及免疫活性功能。

小麦小花细胞核蛋白质双向电泳体系的优化

为建立适用于小麦小花细胞核的分离及其蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)体系,以小麦品种西农1376三核期小花为供试材料,采用叶绿素含量测定、荧光显微镜观察和组蛋白免疫印迹检测等方法对分离和富集到的细胞核进行了纯度评价,并在SDS-PAGE胶浓度和蛋白质上样量等方面对细胞核蛋白质双向电泳体系进行了探索和优化,确立了一套适用于小麦小花细胞核的分离及其蛋白质双向电泳的技术方法。结果表明,获得的细胞核完整且纯度较高;经TCA/丙酮法提取其蛋白质,采用17cm、pH 4~7IPG胶条和12%SDS-PAGE分离胶,上样量为230μg的双向电泳体系,更适合于小麦小花细胞核蛋白质组分离,经PDQuest 2DE 8.0.1软件统计分析,可在2-DE图谱上分辨出约264个蛋白点,蛋白点清晰呈圆形,无横条纹干扰。

黏细菌总蛋白质组双向电泳条件的建立

目的 :建立可以对黏细菌蛋白质组进行阵列分离的双向电泳条件。方法 :以黏细菌模式菌株DK162 2为材料 ,不同方法制备DK162 2在营养性生长阶段的蛋白质组样品 ,双向电泳阵列菌体总蛋白。通过不同条件下电泳图谱的比较建立蛋白质组样品的制备方法和双向电泳的技术条件。结果 :两性离子去污剂CHAPS及还原剂的浓度是影响双向电泳图谱分辨力的重要因素 ;蛋白质组样品的处理必须在低温下快速完成 ,以避免蛋白降解。结论 :初步建立了黏细菌总蛋白质组的双向电泳条件 。

纳米铜对大鼠肝脏毒性的蛋白质组2-DE图谱分析

为获取纳米铜对大鼠肝脏毒性的蛋白质组表达图谱,试验通过构建大鼠纳米铜中毒模型,采用双向凝胶电泳技术获取了大鼠纳米铜中毒组和对照组肝脏的蛋白质2-DE图谱,结合PDQuest 8.0软件分析发现200mg/kg纳米铜组大鼠肝脏2-DE图谱中有27个蛋白质斑点表达上调,16个蛋白质斑点表达下调,共有43个差异蛋白质点。试验利用蛋白质组学技术研究大鼠纳米铜肝脏蛋白质组学,为在蛋白质水平阐明纳米铜的毒性作用机制奠定基础。

桃树枝条皮层响应低温的特异蛋白质2-DE分析

低温是限制桃树生长、发育、繁殖以及地理分布的一个重要环境因子。明确桃响应低温胁迫的分子调控机制有可能为培育和筛选出相对抗寒的桃品系提供研究基础。以抗寒性较强的秋燕桃为试材,将一年生休眠枝条置于-5(CK),-15,-25℃低温处理48 h,应用双向电泳技术(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)测定枝条皮层蛋白质表达变化情况。结果显示:通过质谱鉴定发现,有150个蛋白质点的表达丰度在低温胁迫后发生明显变化,丰度显著上调的有97个,丰度显著下调的有53个,通过蛋白质组数据检索成功地鉴定了其中的20个蛋白,发现这些蛋白质主要参与氨基糖和核苷酸糖代谢、蔗糖和淀粉代谢、氨基酸代谢、MAPK信号通路、苯丙氨酸代谢和DNA的复制等代谢过程。利用RT-PCR验证了Alpha淀粉酶(M5VVU6)、叶绿素a/b结合蛋白(M5WUQ0)和环氧化物水解酶(D8L7V9)蛋白编码的基因,随着低温胁迫的增加而上调表达。研究结果暗示了这些代谢途径和3个特异蛋白可能在桃的抗寒机制中起重要作用。

2型猪链球菌强毒株与无毒株胞外蛋白的双向电泳图谱比较分析

利用双向电泳技术可以对体外培养的2型猪链球菌强毒株和无毒株进行胞外蛋白质组比较,寻找与毒力相关的蛋白质。2型猪链球菌强毒株和无毒株在无蛋白细菌培养液中37℃摇床培养16h,从培养物上清中获得胞外蛋白。第一向电泳用pH4-7线性IPG胶条进行等电聚焦,第二向电泳用SDS-PAGE凝胶再分离蛋白,经过考马斯亮蓝R350染色,图像扫描后,利用软件分析处理图像。在2型猪链球菌强毒株和无毒株的胞外蛋白质图谱中都分别检测出180±10个蛋白质斑点,它们的蛋白质分子质量分布基本相似;在所检测到的差异蛋白质斑点中,其中有50个蛋白斑点只存在于无毒株中而强毒株中不存在,有52个蛋白斑点只存在于强毒株中而无毒株中不存在,有7个蛋白斑点的表达量相差达5倍以上。这为研究2型猪链球菌的致病机理提供了蛋白质组学方面的信息。