高山被孢霉ω-3脂肪酸脱饱和酶基因在麦胚无细胞蛋白质合成系统中的表达

无细胞蛋白质合成系统具有快速、方便等特点,能表达对活细胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽,近年来被广泛应用。以来自产油丝状真菌高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成途径中的关键膜结合酶——ω-3脂肪酸脱饱和酶为研究对象,构建了适宜体外表达ω-3脂肪酸脱饱和酶的表达载体p IVEX WG1.4-FADS15,并利用麦胚无细胞蛋白质合成系统实现了对该基因的高效表达。同时,通过在麦胚无细胞蛋白质合成过程中添加脂质体的方法,将所表达的膜蛋白正确定位至脂质体磷脂双分子层,以便目标蛋白质的正确折叠。研究结果显示,在此实验条件下目标蛋白质的表达量达1.8 mg/m L,经碘海醇密度梯度超速离心纯化后,该蛋白质的纯度可以达到90%以上。研究结果为后续对该酶进行催化特性研究和蛋白质晶体结构解析奠定了基础。

无细胞蛋白质合成系统的研究进展及应用前景

无细胞蛋白质合成系统是现代迅速发展的蛋白质表达系统,以细胞抽提物中酶和蛋白质因子等作为基本反应体系,添加外源模板、底物以及能源物质等维持体系运作,最终在体外合成目标蛋白质。无细胞蛋白质合成系统突破了细胞的生理限制,能够灵活地进行蛋白质合成,极大地提高了蛋白质的产量,不仅可以作为研究转录和翻译的研究工具,而且可以实现蛋白质的高通量表达,在诸多领域带来了突破性的进展。现主要针对无细胞蛋白质合成系统的能量供给、蛋白质的稳定性和折叠修饰以及应用进行综述,以期推动对该技术的理解和应用。

人造细胞内蛋白质合成的研究进展

无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,CFPS)是一种在体外快速合成目标蛋白质的方法,通过构建含有CFPS系统的人造细胞,能够实现蛋白质的高通量表达和功能性膜蛋白的体外重构.本文详细综述了4种CFPS系统(包括大肠杆菌裂解液、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物、酵母提取物)的适用范围和优缺点,总结了基于CFPS系统构建的人造细胞体系内蛋白质合成的研究现状,以及该领域面临的挑战及未来的发展方向.

单蛋白合成系统研究进展

任何一个蛋白质合成系统的最终目标都是表达所需要的蛋白质(目的蛋白质)而不产生其他的细胞蛋白质。目前,只有两种方法可以成功的表达目的蛋白质:体外无细胞蛋白质合成系统和体内单蛋白生产(SPP)系统。综述现今不同的单蛋白生产系统,讨论他们的应用、优点和缺点。

膜蛋白的表达:在无细胞体系中实现功能性表达、折叠和组装

膜蛋白在人类和其他物种的生命活动中都起着至关重要的作用.在已完成测序的基因组中,膜蛋白占据30%.药物作用靶向位点、细胞之间的信号传递以及对外界环境的探测等功能,大多是通过生物膜上的特殊膜受体蛋白实现的.膜蛋白研究在工业、环境、国防、医学等领域具有重大意义.嗅觉受体蛋白是一类典型的膜蛋白,属于G蛋白偶联受体家族.嗅觉受体蛋白调控着生物的食物寻找、危险趋避和求偶行为.其主要分布于脊椎动物鼻腔和昆虫触角.嗅觉受体蛋白可以直接识别气味分子,将生物信号转化为电信号,最终传递至神经中枢,进而做出相关应答.膜蛋白的获取并不容易.天然组织中的膜蛋白含量太低不足以支撑学术研究.异源表达难以实现膜蛋白整合上膜,这给膜蛋白的结构和功能研究带来很大挑战.无细胞蛋白质合成系统是一个开放体系,且不依赖细胞活性,是体外表达蛋白质的有效方法.通过无细胞蛋白合成体系,在体外实现膜蛋白二聚体的自组装,将为膜蛋白研究带来全新突破.本文总结了用于无细胞表达的膜蛋白研究进展.

超高温下的生命

根据传统的看法,当生物体处于80℃以上高温中时,组成它的基本骨架--蛋白质分子将会发生变性,分子结构趋于解体,于是"生"的特点也将无法维持下去.所以,人们一般认为,100℃的条件下是不可能存在任何生命实体的.譬如拿大家熟悉的"高温灭菌"来说,就是在100℃条件下是杀死所有杂菌的有力措施.这一方法至今还运用不衰,没有人对它产生过怀疑.

氟化物对亚细胞的影响

氟化物对人体、动物及植物的危害已引起世界范围的普遍关注 ,其在体内外对不同组织产生的毒理学作用的研究日益深入。本文从较深的层次阐述了氟化物的毒理学作用 ,涉及了氟化物对单位膜、线粒体、核酸、多肽以及蛋白质合成系统的影响。

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶.以拟南芥生态型“Columbia gll”及甘蓝型油菜三系“陕2A”,“陕2B”和“垦C1”的叶片为材料,采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因.同源性搜索发现,来源于油菜的克隆基因是新基因.将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点,构建表达重组体,均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白.亚基0,亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统,体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力.不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明,NAD-IDH由3种亚基组成,缺一不可,缺少亚基0是致命的,缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的.同时发现,来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象,从而发生移框突变或无义突变,使突变亚基不表现正常亚基1功能,导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.