贯穿式实验情境在“细胞的功能主要由蛋白质完成”教学中的应用

利用生物组织中蛋白质含量检测实验为情境主线,围绕实验设计情境问题链,通过师生共同探讨、模型建构、实验探究等多种教学活动形式解决问题,理解蛋白质概念内涵,培养学生核心素养。

紫外-可见分光光度法检测高纯度人C1酯酶抑制剂蛋白质含量的经验公式

目的建立高纯度人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)蛋白质含量(质量浓度)检测的紫外-可见光分光光度法(简称A_(280 nm)法),得到双对数方程的经验公式,用于C1-INH精纯阶段含目标蛋白样品的蛋白质含量在线检测。方法以1批高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度98.49%的C1-INH原液作为对照品,用注射用水稀释获得不同质量浓度的稀释品,分别检测稀释品A_(280 nm)值,以稀释品的A_(280 nm)值与理论质量浓度进行不同方程的线性拟合,选取回收率在理论值100%±10%、R^(2)>0.99的质量浓度区间建立最佳拟合方程。在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合得到不同的方程,对2种拟合方程的准确度、精密度和稳定性进行验证。通过原始值均值方程和不同基质液的检测均值来建立经验公式,用该经验公式计算不同批次纯化工艺中间样品的蛋白质质量浓度并与免疫比浊法和凯氏定氮法的检测结果进行比较,确定其准确性。用该经验公式指导C1-INH精纯样品的检测。结果建立的A_(280 nm)法采用双对数方程拟合标准曲线的线性范围为0.214~3.567 mg/mL;在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合双对数方程,2个标准曲线的重复性和稳定性均较好,且高、中、低值质控品及检测下限的准确度(即回收率)<100%±7%,精密度CV<3%。含目标蛋白质的多种基质液按照原始均值方程计算得到对应的蛋白质质量浓度在0.044~0.064 mg/mL,均值为0.051 mg/mL;经验公式为:蛋白质质量浓度x={10(lg(y)+0.3820.764)-0.051}×稀释倍数,用该公式计算的添加了对照品的各基质的回收率在96.636%~109.533%。检测不同批次纯化工艺中间样品的结果显示,对于精纯样品,该经验公式与凯氏定氮法的结果比值在0.93~1.12,免疫比浊法结果与凯氏定氮法的结果比值在1.19~2.33。用该经验公式计算的不同精纯阶段中间样品的结果与凯氏定氮法结果更接近。结论建立的A_(280 nm)法经验公式可用于精纯阶段的高纯度C1-INH样品的蛋白质含量在线快速检测。

蛋白质含量测定的教学改进

凯氏定氮法是经典的蛋白质含量测定方法,在科学研究和生产实践中应用广泛。蛋白质折算系数(NPF)是影响该法结果准确性的关键参数,在现行的生物化学教材中多数认为该值近似为6.25,实际上由于原料的化学组成不同,NPF可能与6.25有较大差异。这一点在教学过程中很容易被忽视,使教学内容不准确,甚至影响学生未来的实际应用。教师在课堂中进行教学改进,系统介绍了凯氏定氮法及NPF的研究历史,整理了常见原料的NPF,同时还总结了不同蛋白质测定方法的优缺点和适用条件,并以白菜为例比较了凯氏定氮法和考马斯亮蓝法测试结果的差异。这些内容不仅可以拓宽学生视野,让学生对凯氏定氮法及NPF有更加科学的认识,还是对现有课程教学内容的补充和完善,为今后国内生物化学等相关课程教学改革提供了参考。