有机玻璃微流控芯片表面的蛋白质固定化及应用研究

高分子聚合物由于具有种类繁多、价格低廉、加工方法多种多样以及容易实现批量生产等优势,已越来越多地成为微芯片材料的首选[1];将生物分子固定于固相载体上,与底物发生异相生化反应,从而使得产物易与反应体系分离,并可多次重复使用,无污染且大大降低消耗等特点而备受关注[2].……

纳米材料在蛋白质固定方面的应用研究进展

将纳米材料分为非金属氧化物、非金属单质、金属氧化物、金属单质以及纳米聚合物,介绍了它们的特性及近十年来在蛋白质固定吸附方面的研究现状,并展望了它们的应用前景和发展趋势.

分子对接预测手性化合物在蛋白质固定相色谱柱上的保留行为

利用分子对接技术预测了2种蛋白质固定相分别与4对手性化合物的相互作用情况。结果表明,预测结合自由能(ΔG)的大小与对映体(R-(+)型和S-(-)型)的出峰顺序一致;结合自由能差值的绝对值(Δ(ΔG))与实验分离因子(α)大小顺序一致。说明分子对接可以反映蛋白质对不同的手性化合物的识别能力和化合物R-(+)型和S-(-)型的出峰顺序。

基于图神经网络的固定骨架蛋白质设计方法研究

针对图神经网络(GNN)ProteinSolver结构特征约束不充分的问题,增加了骨架二面角、配对氨基酸的相对位置编码和相对方向等结构约束,提出了一种基于GNN的固定骨架蛋白质设计方法。实现了基于Transformer多头注意力机制的GNN架构,将物理坐标添加到消息传递和更新步骤中,提高了原子坐标的等变特性。在CATH数据集上的训练和测试结果显示:该文模型平均困惑度为8.12,比ProteinSolver的平均困惑度8.97降低了0.85;在掩盖率为50%时,ProteinSolver的恢复率为28.7%;然后,增加更多的结构约束,恢复率达到了30.3%;随后,将ProteinSolver的GNN替换成基于Transformer的GNN,恢复率达到了34.3%;最后,通过再引入等变特性,恢复率进一步提高到35.0%。

固定化蛋白质色谱模型的建立及其在先导化合物筛选中的应用

目的建立基于固定化蛋白质的色谱模型,并将其应用于先导化合物的快速筛选和初步评价。方法构建融合卤代烷烃脱卤素酶标签(halogenated alkane dehalogenase tagged,Halo-tagged)的β_(2)-肾上腺素受体(β_(2)-adrenoceptor,β_(2)-AR)重组质粒,用热击法将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达获得大量融合Halo-tag的β_(2)-AR,通过Halo-tag与6-氯己酸修饰的微球的特异性反应将细胞裂解液中的β_(2)-AR一步捕获至硅胶表面,获得β_(2)-AR色谱固定相,用该色谱固定相测定甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗的结合常数为4.9×10^(3)、9.9×10^(3)、2.0×10^(4) L·mol^(-1),对应的解离速率常数为8.1、13.8、5.7 s^(-1),建立固定化蛋白质色谱模型。结果用该方法对先导化合物XC267的成药性进行评价,测得其与β_(2)-AR的结合常数为4.4×10^(3) L·mol^(-1)、解离速率常数为8.7 s^(-1),证实XC267是β_(2)-AR的潜在激动剂。结论建立的固定化蛋白质色谱模型能用于先导化合物的筛选和快速评价,方法特异性高,稳定性好,为其他先导化合物的前期评价提供了方法学借鉴。

一种验证SPR传感器金膜表面固定蛋白质分子有效性的简易途径

利用表面等离子共振传感器进行免疫检测的实验中,需要在化学性质稳定的金膜表面固定蛋白质分子探针。如何验证一种方法是否能够成功固定蛋白质分子具有非常重要的现实意义。提出的验证方法采用酶反应作为标志,如果某种方法确实能有效固定蛋白质分子,那么它也能固定酶。将固定好酶的金膜浸入相应的底物溶液中发生变色反应,测量底物溶液的吸收光谱,即可根据结果判断是否有效固定了酶,同时达到判断这种方法是否可固定蛋白质的目的。具有快速、方便、低成本等优点。采用经过验证的方法固定抗IgG后通入IgG,实验响应良好。

高效液相色谱中的蛋白质手性固定相

对近年来报道的各种高效液相色谱蛋白质手性固定相的研究进行了综述.主要介绍了蛋白质手性固定相的制备、分类、组成、性质、拆分机理及其应用,讨论了各类蛋白质手性固定相的优缺点,指出了目前存在的问题和今后的研究方向.

蛋白质化学键合固定相与手性药物的HPLC分析

阐述用于手性药物拆分的蛋白质化学键合固定相：a1-酸性粘蛋白、卵类糖蛋白、牛血清蛋白。人血清蛋白等固定相的使用条件、应用范围、手性识别机理及发展方向。

毛细管柱固定蛋白质方法的研究进展

在熔融石英毛细管中,固定化的蛋白质(酶)在手性拆分、蛋白质肽谱、药物筛选、样品预浓缩等方面具有重要应用。本文对用于毛细管中蛋白质固定的溶胶-凝胶法、物理吸附法、离子鳌合吸附法、基于脂质的蛋白固定和共价键合法进行了综述。

GMR免疫芯片的蛋白质固定及检测研究

采用磁控溅射、光刻、离子束刻蚀、及剥离工艺等技术和方法,制备了多层膜结构的阵列式巨磁电阻(giant magneto resistive,GMR)传感器芯片,可同时对多指标进行检测,并研究了GMR生物传感器上蛋白质分子的固定及检测。传感器表面通过等离子体与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)修饰后,可特异性地结合抗体分子。在蛋白质分子的固定实验中,使用人免疫球蛋白G(im-munoglobulin G,IgG)作为探针修饰在传感器表面,以捕获生物素标记的驴抗人IgG,,并通过亲和素标记过的直径300nm的超顺磁磁珠检测GMR生物传感器的信号。本实验对五种浓度的驴抗人IgG进行了检测,得到了4～164mΩ的GMR电阻变化值,且GMR信号与驴抗人IgG的浓度呈半对数关系。该阵列式GMR传感器芯片可用于定量检测生物样品中某种或某几种蛋白浓度的实验,并有望未来应用于临床检测中。

BmNPV多角体蛋白片段引导外源蛋白固定入多角体的研究

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)晚期产生大量多角体,其主要作用是包埋病毒粒子免受外部恶劣环境的影响,为次代感染提供保障。将BmNPV多角体基因分段克隆并与报告基因——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,利用BmNPVPolh+Bac-to-Bac表达系统构建重组病毒,使多角体蛋白与融合蛋白在BmN细胞内共表达。分析感染细胞和形成的多角体中融合蛋白的含量,研究不同的多角体蛋白片段引导EGFP固定入多角体的效果,结果表明构建的5种重组病毒都能大量表达融合蛋白,每种多角体蛋白片段都能引导EGFP固定入多角体内部,且外源融合蛋白在多角体总蛋白中占有较高的比例,其中,以多角体蛋白N末端100个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定EGFP的效率最高。这一现象为解决活性蛋白长期保存提供了新思路,同时对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体也具有较好的参考价值。

利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察

家蚕核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生多角体蛋白,并形成结构致密的超大分子蛋白质晶体,以有效保护内部包埋的病毒粒子,保证子代病毒的传播。借鉴多角体包埋病毒粒子的原理,观察到多角体也能将外源蛋白质固定入多角体内部。利用能形成多角体的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建的含有绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒能在表达、产生正常多角体的同时也表达EGFP蛋白。共聚焦分析表明,该重组病毒感染后形成的多角体能够发射绿色荧光。被包埋的EGFP蛋白放置1个月后仍能检测到绿色荧光,干燥处理30min后仍能检测到荧光。由此说明将多角体与外源基因同时表达,多角体中会包埋外源蛋白,且能较长时间保存外源蛋白的生物活性。这一现象为解决蛋白质长期保存提供了新思路,对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂也有很好的参考意义。

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。

蛋白质类手性固定相的研究进展及其在药物手性拆分中的应用

手性药物的色谱拆分方法包括手性衍生化试剂法、手性流动相添加剂法和手性固定相法等。随着大量商品化手性固定相色谱柱的出现,手性固定相法以其快速、简便、高效的特点,迅速在药物手性拆分领域占据主导地位。蛋白质类手性固定相是应用最为广泛的手性固定相之一,它能够提供多种类型的相互作用力和手性识别位点,对不同类型的药物具有广泛的手性识别能力。本文综述了蛋白质类手性固定相的研究进展,及近3年其在药物手性拆分中的应用,讨论了各种固定相的性质特点、适用范围、影响药物手性拆分的因素以及色谱方法优化流程等。

非小细胞肺癌组织中p38蛋白的表达及其与吸烟的关系

目的:检测非小细胞肺癌组织中p38的表达,探讨其与患者吸烟的关系。方法:应用固定化蛋白质印迹法检测52例非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中p38的表达情况;免疫组织化学法分析其在细胞内的定位。结果:肺癌组织中p38的表达水平与癌旁正常组织无明显差别(P>0.05);27例(51.9%)标本肺癌组织中p38蛋白的表达水平高于癌旁正常组织(P>0.05);p38的表达在腺癌组织中明显增加,与肺癌肿瘤直径大小、淋巴结转移及TNM分期无关。而不吸烟患者癌组织标本中p38的表达水平较吸烟者高,为吸烟者的2.3倍(P<0.01);不吸烟者腺癌组织中p38的表达水平显著增高。免疫组织化学显示p38分布在胞浆内。结论:p38在肺腺癌不吸烟者中过表达,可能在不吸烟者的肺癌发生过程中起着重要作用。

剪切流动法研究表面固定化配基与目标分子的相互作用力

基于剪切流动腔技术,以微球作为受力载体,设计了一套可用于研究表面固定化配基与目标分子特异性相互作用力的实验和分析方法,并以人免疫球蛋白G(humanIgG)和羊抗人免疫球蛋白G(goatanti-humanIgG)分别作为模型配基和模型目标分子进行了研究.基于平面Poiseuille层流模型设计了流场参数,以数值计算结果验证了设计的合理性.使用牛血清白蛋白(BSA)作为非特异性对照,判断微球与基片表面的结合力来自配基和目标分子的生物特异性相互作用,并由进一步的目标分子灭活对比实验确认了这一结论.实验观察到微球与基片表面的结合力受到配基面密度的影响,说明发生结合的是多对而非单对蛋白质分子.将95%的微球被剥离时对应的壁面剪切率设定为临界剪切率,由大量实验结果拟合得到了临界剪切率与配基面密度间的定量关系.在受力分析模型中,考虑到多分子的结合,以及分子键位置不同造成的力臂长度的差异,最终计算得到单对配基与目标分子的平均结合力约为342pN.

应用光亲和分子进行PEG的光照修饰及蛋白质的光照偶联

合成了一种光活性标记分子-对叠氮苯甲酸,将其偶联到具有双羟基的碳酸酯与乳酸的共聚物P(LA-co-DHP)上,获得了具有光反应活性的可生物降解共聚物P(LA-co-DAP),在光照条件下,可以将蛋白质方便快捷地共价偶联到P(LA-co-DHP)聚合物纤维上.在溶液中进行PEG与对叠氮苯甲酸的光照反应,通过核磁共振光谱检测,证明了对叠氮苯甲酸可以直接修饰到PEG侧链上,形成苯甲酸侧基PhCOOH.这是其它化学修饰方法很难做到的.实验还证明,对叠氮苯甲酸对PEG的光亲和修饰不但能在溶液中进行,而且能在PEG自组装膜的表面进行.

用共价偶联方法研制压电晶体免疫传感器

以牛血清蛋白（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）及其抗体为检测对象，用常用的硅烷化合物ＡＰＴＥＳ固定蛋白研制石英晶体免疫传感器。测定了ＢＳＡ在石英晶体上的固定饱和曲线及甘氨酸（Ｇｌｙ）对戊二醛的封闭效应。特异性结合的ＢＳＡ可以用０．２ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸洗脱，抗ＢＳＡ抗体膜可以重复使用，但其活性下降。

磷酸化p38在非小细胞肺癌中表达的意义

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶p38在非小细胞肺癌组织中的表达与活性,以及它与肺癌临床病理特征之间的相关性。方法应用固定化蛋白质印迹法检测52例非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中p38和磷酸化p38(P-p38)的表达情况;免疫组织化学法分析其在细胞内的定位。结果肺癌组织中p38的表达水平与癌旁正常组织无明显差别(P>0.05);而所有癌组织标本中P-p38的表达水平全部增高,为癌旁组织的2.1倍(P<0.01);P-p38的表达在鳞癌、腺癌组织中无明显差异,与肺癌肿瘤直径大小、淋巴结转移及TNM分期无关。免疫组织化学显示p38分布在胞浆内,而P-p38在胞浆和胞核内均有表达。结论p38的过度激活可能在肺癌的发生、发展过程中起着重要作用。