基于M13噬菌体展示单链抗体文库的新型蛋白质均衡器的研制及其在肾病患者尿蛋白分析中的应用

通过将展示单链抗体(scFv)文库的M13噬菌体固定于冷凝胶整体柱表面制备了一种新型蛋白质均衡器。由于展示的scFv片段具有种类多、数目大以及与蛋白质结合的特异性强等优点,因此其非常适合用于复杂蛋白质样品的预处理。将肾病患者尿蛋白在平衡器上反复上样5次后,依次使用2mol/LNaCl、50mmol/LGly-HCl(pH2.5)和凝血酶溶液洗脱与均衡器结合的蛋白质,收集各馏分,并采用串联微柱反相液相色谱-电喷雾质谱进行蛋白质的分离鉴定。与未经均衡器处理的样品相比,鉴定的蛋白质数目由142个提高到396个。此外,凝胶电泳的分析结果显示,在上样流出液中蛋白质的浓度差异明显变小,大量的高丰度蛋白质存在于NaCl洗脱液中。上述结果表明,基于M13噬菌体展示scFv文库的新型蛋白质均衡器能够有效减小样品中蛋白质的浓度差异,有利于发现更多的低丰度蛋白质。

二维阵列色谱分离系统及其在血浆蛋白质组中的应用

本研究发展了在线二维阵列式液相色谱系统,对血浆蛋白质进行分离分析。在线二维阵列式液相色谱系统进行血浆样品的蛋白质水平分离,整个分离过程仅需4 h,并能进行高丰度蛋白质的快速定位。相比于高丰度蛋白质馏分的直接鉴定,经蛋白质均衡器材料富集后,鉴定得到的低丰度蛋白质数量提高了10倍,低丰度蛋白质的损失大幅度减少。本研究将二维阵列色谱分离系统对血浆样品进行完整的分离分析,共鉴定到了1474种蛋白质,蛋白质浓度动态范围达到了7个数量级。高丰度蛋白质馏分中共鉴定到252种蛋白质,其中有61种为高丰度蛋白质。结果表明,在线二维阵列式液相色谱系统实现了血浆样品中高丰度蛋白质的快速去除和高丰度蛋白质馏分中低丰度蛋白质的富集,显著提高了血浆蛋白质的鉴定能力,在其它复杂样品的分离分析中具有一定的应用前景。