从药物多肽到蛋白质全合成:酶促拼接的方法原理与前沿应用

蛋白质是生命活动的基础功能元件,其化学合成与定点修饰已成为合成生物学领域探索复杂生物大分子“结构-功能”关系的重要前沿方向。近年来,以多肽固相合成与特异性拼接为核心的蛋白质合成和修饰技术蓬勃发展,打破了生命合成系统仅能使用天然及少数非天然氨基酸的瓶颈,为制备含有数百个氨基酸残基的非天然蛋白质提供了技术平台,让原子水平的蛋白质人工设计成为现实。作为一类广受关注的多肽拼接策略,基于天然或人工改造多肽连接酶的技术方法不仅在基础研究领域拓展了人们对蛋白质这一生命核心元件的理解,还在工业领域崭露头角,被应用于多种多肽类药物的生产。针对蛋白质合成领域中酶促多肽拼接技术平台,本文介绍了Sortase A转肽酶、Butelase 1转肽酶以及Subtilisin人工连接酶的来源以及催化过程,探讨了各自的优势以及局限性,并综述了三种酶在蛋白质修饰、蛋白质合成、多肽药物环化等方面的应用。通过计算机辅助设计、定向进化等技术对转肽酶、连接酶进行改造来提升其在底物谱、催化活性等方面的特性,将化学方法与酶促方法联用来建立多样的生物大分子从头设计与合成路线是目前的主要发展趋势。

顺磁标记蛋白质在溶液与细胞内研究中的应用

核磁共振中的顺磁效应,包括顺磁弛豫增强、赝接触位移和残余偶极耦合,是研究生物大分子结构、动态变化与相互作用的重要结构约束条件.定点顺磁标记大分子是获得该类结构约束的重要途径.本文论述了生物核磁中顺磁效应的基本原理,蛋白质定点顺磁标记路线和方法,以及在生物核磁中产生顺磁弛豫增强、赝接触位移和残余偶极耦合等顺磁效应的标签质量评价.在介绍该领域最新重要进展的基础上,本文主要讨论了本课题组通过利用顺磁效应在结构生物学和化学生物学中的工作:多结构域蛋白质中的结构域动态取向分析;非平衡态下低含量、不稳定蛋白质复合物的三维结构测定;赝接触位移测定活细胞内蛋白质的三维结构;顺磁核磁和电子自旋共振在结构生物学研究中的互补性以及应用双电子自旋共振在细胞内高分辨距离测定方法.顺磁定点标记蛋白质等生物大分子是获得该类大分子在近生理状态下高分辨动态结构与变化信息的重要方法,预计该技术会在细胞内研究中得到广泛应用.

酵母朊蛋白Sup35NM的寡聚化过程研究

本文研究了与神经退行性疾病相关蛋白有类似聚集行为的模型蛋白质酵母朊蛋白Sup35NM的错误折叠过程,特别是初始的寡聚化过程.为了延缓和阻止朊蛋白Sup35NM在磷酸盐缓冲液中(体外条件)的聚集以利研究,在Sup35NM的N结构域第31位点处突变并修饰了一个聚合物分子PNIPAM(即蛋白质-高分子结合物Sup35NM-31m-PNIPAM).硫代黄素T荧光光谱实验显示,修饰延缓了Sup35NM的寡聚化,并给出了研究寡聚化的时间窗口:25℃时,修饰前后分别是~10和24 h.激光光散射实验进一步证实了修饰阻碍Sup35NM寡聚化聚集.运用Smoluchowski模型公式,拟合了激光光散射实验数据,定量地给出并对比了修饰前后两个样品在聚集初期(6 h内)的寡聚体分布.结果显示,在引发聚集6 h后,未修饰样品中的蛋白质单体仅剩13%,而在PNIPAM修饰后的样品中蛋白质单体则仍占46%.本工作为可控、定量研究朊蛋白寡聚化提供了新思路.