重组肺炎链球菌甘油脱氢酶活性及晶体培养的初步分析

甘油脱氢酶能够氧化胞内甘油为代谢活动提供能量,并参与调控宿主粘附相关细菌蛋白质的表达,是潜在的抗菌药物靶点.本文利用大肠杆菌BL21原核表达肺炎链球菌甘油脱氢酶,获得大量上清表达的目的蛋白.再用Ni-NAT-Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析以及Superdex 200分子筛进行纯化.经数据拟合,证实该酶在溶液中以同源二聚体形式存在.光谱实验证实,该重组表达甘油脱氢酶仍具有氧化甘油生成1,3-二羟基丙酮的活性.用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体,在0.1 mol/L Bicine pH 9.6,13%PEG MME 5000,0.2 mol/L KSCN,4%Dioxone条件下,得到了晶型好且有一定衍射能力的单晶,为解析肺炎链球菌甘油脱氢酶的三维结构及研究结构与酶活之间的关系奠定了基础.

金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrE的表达、纯化及晶体生长

目的:对金黄色葡萄球菌表面蛋白质(serine-aspartate repeat,SdrE)进行克隆表达纯化及晶体培养,以期解析其三维结构,进而深入分析金黄色葡萄球菌感染的分子机制,为研发新的抗菌药物提供基础。方法:利用PCR技术扩增SdrE基因,构建重组质粒pW28-SdrE,并在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)B834中表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化SdrE蛋白质,再用Hiload Superdex 200凝胶层析柱分析其在溶液中的聚集状态,用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体。结果:(1)构建了重组质粒pW28-SdrE,并在E.coli B834中可溶性表达。(2)获得了纯度较高(85%)的SdrE蛋白质,该蛋白质在溶液中以单体形式存在。(3)培养出晶形较好、衍射能力较强的SdrE蛋白质单晶。结论:利用经典的蛋白质纯化技术和晶体培养技术,可以获得衍射能力较强的SdrE单晶,为其三维结构的解析和基于结构的新型特异性抗菌药物的研发提供了重要的基础。