人蛋白质二硫键异构酶cDNA基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人胚胎肝组织中分离纯化出总ＲＮＡ，在总ＲＮＡ中提取ｍＲＮＡ，经逆转录得到ｃＤＮＡ第一条链，并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物，进行ＰＣＲ合成人蛋白质二硫键异构酶（Ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＤＩ）ｃＤＮＡ基因，将所得ｃＤＮＡ克隆到质粒ｐＵＣ１８上，转化大肠杆菌ＤＨ５α细胞，进行诱导表达筛选和活性筛选。将筛选的基因克隆到载体ｐＢＶ２２０上，在大肠杆菌细胞中表达，产物以溶解形式在胞浆中表达。表达产物经硫酸铵分级沉淀和ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ柱层析分离，产物的纯度与活性分别为９０％、１１００ｕ／ｇ。

大肠杆菌核糖体蛋白质L24和L27突变对λN和λQ基因表达的影响

核糖体是生物体翻译遗传密码的唯一埸所,核糖体各组份的确切功能目前仍不清楚,本实验室的研究已证实:有些核糖体蛋白质突变能在翻译水平上影响核糖体翻译的特异性,本文使用转座子Tn10将核糖体蛋白质L24(rpIX)和L27(rpmA)突变从A19的衍生株转到T83菌株上,并研究这2个突变对λN和λQ基因及对N-lacZ和Q-lacZ融合基因表达的不同影响,为核糖体蛋白质能影响核糖体翻译的特异性提供了又一个实例。

马铃薯无机焦磷酸酶基因cDNA在大肠杆菌中的表达及蛋白质特征分析

通过调节蔗糖代谢途径中的协同因子无机焦磷酸（PPi）可以调控马铃薯块茎的休眠和发芽特性。本研究将马铃薯无机焦磷酸酶（PPase）基因（Gen Bank Accession No：EF091820）与载体pET-28a融合，构建了原核表达载体pET—PPA，然后导入大肠杆菌BL21（DE3）中，经SDS-PAGE分析表明PPase基因在大肠杆菌中能够表达。用生物学软件对PPase基因及其编码的蛋白质分析表明，该PPase基因与与茄属的同源性高达89％-97％，与其他物种PPase基因的同源性在77％-80％之间；系统进化树分析表明PPase与茄科茄属和藜科甜菜属的进化类群最接近；其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点，没有跨膜区;蛋白质二级结构预测显示，有63个氨基酸可能形成α-螺旋结构，38个氨基酸可形成延长链；通过亚细胞定位可知，它主要是一种细胞质和线粒体基质蛋白。

HBV PreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌pMALP2x系统中表达HBVPreS2MBP融合蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2蛋白基因克隆至原核表达载体pMALP2x中,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达产物经SDSPAGE和Westernblot检测,并经阴离子交换层析、AmyloseResin亲和层析纯化。结果成功构建了重组载体pMALP2x/S2,诱导蛋白为MBP标记的可溶性的PreS2MBP融合蛋白,具有良好的抗原性,可经AmyloseResin亲和层析纯化。结论pMALP2x系统可成功表达PreS2MBP融合蛋白。

鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和Ⅱ在大肠杆菌中的表达及鉴定

为了实现鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和II在大肠杆菌中的表达。利用PCR方法扩增得到目的片段,并引入FLAG标签序列(DYKDDDDK),构建重组表达质粒pET28a-E-I/II。转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达目的蛋白质,并对其进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果显示,PCR扩增得到约900 bp的目的片段,经鉴定成功构建重组表达载体pET28a-E-I/II。重组菌在IPTG诱导4 h后在37 000处出现目的蛋白质并且表达量达到高峰。经超声波破碎后SDS-PAGE分析显示,融合蛋白质以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白质与FLAG单抗和E蛋白质阳性血清均可发生特异性反应。表明鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域Ⅰ和Ⅱ在大肠杆菌中成功表达,经鉴定重组蛋白质具有良好的免疫反应性。

利用大肠杆菌发酵获得高产量可溶性蛋白质的研究

在大肠杆菌(E.coli)中表达目的基因,进而大规模生产可溶性蛋白质是基因工程研究中的一个重要环节。在本研究中,我们的目的是利用优化过后的大肠杆菌固定化发酵技术,以求得更高的目的蛋白质表达产量。首先,通过对大肠杆菌发酵过程中培养基成分、温度、pH值以及溶氧等培养条件进行优化,最终确定最佳的发酵条件。在最优条件下,不仅可以保证大肠杆菌的高效生长,也可大幅度提高目的蛋白质产量。然后,我们通过十二烷基硫酸钠(SDS)-PAGE以及葡聚糖(Sephadex)凝胶柱层析两种纯化方法对所得蛋白质进行纯化处理,从而得到高纯度的可溶性蛋白质。在此基础上,我们需要对所得到的蛋白质进行生化特性分析,以验证其活性。经过一系列的精细化工艺调控,最终可显著提高大肠杆菌目的蛋白质表达的产量,得到纯度高,活性强的目的蛋白质。本研究,可对工业生产中相关的生物技术提供新的实用方法和理论参考。

HCV NS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯

应用 PCR方法扩增出人丙型肝炎病毒全长 N S4基因的 DNA片段 ,克隆入表达载体 p QE3 2并转化E.coli JM10 9,经 IPTG诱导表达出 4 2× 10 3蛋白 .利用 Ni- NTA- agarose纯化得到纯化产物 ,Western- blot鉴定该蛋白能够与抗 NS4的单克隆抗体发生特异性反应 .

一种蛋白质纯化流程用于提纯大肠杆菌表达的蛋白片段

用一种新的蛋白质纯化流程提纯由大肠杆菌表达的夏氏疟原虫AMA1片段。大肠杆菌表达的片段首先用镍柱提纯 ,提纯后的蛋白用DTT还原 ,对盐酸胍透析 ,再对空气氧化。用RP HPLC对片段二次提纯 ,通过冻干转换缓冲液。SDS PAGE、RP HPLC和质谱分析都显示 ,经这种纯化流程提纯的蛋白有很高的纯度 ,且二硫键已完全正确形成。提示这一蛋白质纯化流程可用于由大肠杆菌表达的低分子量寡二硫键的蛋白。

用质粒pUC18在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶

用质粒ｐＵＣ１８在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶高音，王志珍（中国科学院生物物理研究所，生物大分子国家重点实验室，北京１００１０１）蛋白质二硫键异构酶（ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＤＩ）催化蛋白质分子内天然二硫键的形成，...

猪源大肠杆菌 O157：H7与 O157的差异蛋白质组学分析

为了阐述O157:H7与O157的致病力差异与蛋白质表达差异之间的关系,我们利用双向电泳技术和质谱技术对大肠杆菌两类菌株之间进行蛋白质组学差异分析。菌体蛋白经双向电泳技术分离后,利用软件Image Master TM2DPlatinum7.0对所得双向电泳图谱进行差异分析并借助质谱技术对差异蛋白质点进行鉴定,获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的菌体总蛋白的双向电泳图谱。两样品图谱差异分析结果表明,共确定了28个有效的蛋白质差异点(Av.ratio>2.0,ANOVA<0.05),经质谱鉴定将这28个差异点注释成23种蛋白质。对得到注释的23种蛋白质进行功能分类,发现7类蛋白质与致病性密切相关,即溶菌酶抑制剂、通用应激蛋白、LuxS、鞭毛蛋白以及3种外膜蛋白。本结果将为进一步研究O157:H7菌株的致病因子,探究O157:H7与其它大肠杆菌菌株的致病力差异,以及建立快速鉴别诊断O157:H7的试剂盒提供重要的依据。

贻贝足蛋白fp-5在大肠杆菌中的表达、修饰与功能分析

将地中海贻贝足蛋白fp-5与不同细菌来源的酪氨酸酶在大肠杆菌中共表达,通过体内修饰获得性能改善的贻贝足蛋白。在对序列分析和密码子优化的基础上,分别构建包含酪氨酸酶与贻贝足蛋白基因的单载体和双载体共表达系统,以实现其在大肠杆菌中表达。纯化后的蛋白通过NBT/Gly染色试验和酸-硼酸盐差异光谱法分析,表明fp-5发生了不同程度的羟基化修饰,其中fp-5与来源于多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum)的酪氨酸酶(TyrVs)共表达得到的5-Vs质量浓度为18.6 mg/L,修饰率达到55.20%,黏附力约为未修饰fp-5的4.6倍。与体外修饰贻贝足蛋白相比,TyrVs体内修饰得到的5-Vs具有广泛的羟基化水平以及优秀的附着力和黏附力,为生物医药等领域提供了一种有潜力的生物胶材料。

大肠杆菌新菌毛抗原的研究Ⅱ．菌毛抗原蛋白质特性测定

用保温法和裂解法可以有效提取Ｆ_(１９８７)新菌毛抗原蛋白质；该菌毛蛋白经区带电泳显示主、次两个组分，在０．０６ｍｏｌ／ＬｐＨ８．６巴比妥缓冲液电泳条件下，均向阳极泳动；免疫电泳显示两条沉淀线；其分子量为１９１００Ｄａ；等电点为３．０；由天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、胱氨酸等１６种氨基酸组成。

枯草芽孢杆菌优化表达蛋白质谷氨酰胺酶的研究

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)作用于大分子蛋白质或其小侧链的谷氨酰胺,使其脱酰胺变成谷氨酸可提高蛋白质溶解性和乳化性,在食品行业应用广泛。PG来源于解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum),但原始解脘金黄杆菌菌株表达PG产量较低。为提高蛋白质谷氨酰胺酶表达水平,将来源于解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶基因优化密码子,将密码子换成枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)偏爱密码子,再将密码子优化前后的PG基因分别连接至表达载体pBSA43,最后转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行高效表达。结果显示,密码子优化前重组菌株的PG酶活力为1.83 U·mL^(-1),优化后重组菌株的PG酶活力为2.91 U·mL^(-1)。为进一步提高PG表达水平,经响应面分析优化后,确定最佳发酵条件:发酵时间为62.3 h,发酵温度为32.5℃,培养基初始pH为7.24。在该条件下,密码子优化后重组菌株PG酶活力为5.76 U·mL^(-1)。来源于解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶基因经密码子优化后,表达水平明显提高,为蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达提供参考。

大肠杆菌基因中密码子前后碱基的使用与蛋白质结构

对一组E.coli基因中编码蛋白质各类二级结构 (α -螺旋、β-折叠片、无规卷曲和回折 )的密码子前后碱基的使用情况进行统计分析和比较 ,发现一些密码子前后碱基的使用有偏向 ,而且这些偏向与蛋白质的二级结构有关联。这同时亦表明 ,E.coli基因中同义密码子的选用与蛋白质的二级结构有一些关联。模型对于蛋白质结构预测算法的改进以及基因工程的研究有辅助作用。

酵母和大肠杆菌基因表达谱与蛋白质相互作用的相关性分析

为了研究酵母和大肠杆菌基因表达谱与蛋白质相互作用的关系,构建了蛋白质相互作用正负样本集.结合基于Pearson相关系数的共表达基因,分析了在受到外界刺激后,生物体内有相互作用的蛋白对与非相互作用的蛋白对之间的关系.结果显示,大肠杆菌和酵母在应激反应之后至恢复稳态的时间内,有相互作用的蛋白对与非相互作用的蛋白对之间的变化存在显著差异,对比发现非相互作用的蛋白对的基因表达谱具有较高的变化幅度.进一步分析了两物种的基因共表达网络,并阐述了作用机理.

基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力

为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验共检测到121个差异表达蛋白,其中44个蛋白的表达水平上调,19个蛋白的表达水平下调。为研究ryhb对表达蛋白的影响情况,并鉴定受其调控的相关基因,从上述差异蛋白中筛选出了hdea、hdeb、gada、gadb等与酸性耐受力相关的蛋白,并在基因水平进行验证。本研究表明,ryhb基因的缺失可能与上述4个耐酸基因转录水平上调相关,进而增强APEC耐酸性。本实验为初步探究ryhb调控通路,对APEC致病性影响提供了一定的实验依据。

大肠杆菌多重耐药株与敏感株蛋白质组差异分析

【目的】研究临床分离的大肠杆菌多重耐药株(R)与大肠杆菌标准株ATCC 25922(S)蛋白质差异表达情况,为进一步研究大肠杆菌耐药机理奠定基础。【方法】采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)法结合平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术,对大肠杆菌R和S株的全菌体蛋白进行定量蛋白质组学研究,筛选大肠杆菌多重耐药株(S)与敏感株(R)之间的差异表达蛋白,并对其生物信息学进行分析。【结果】共筛选出300个差异表达蛋白(Fold change≥1.3,P<0.05),其中上调167个,下调133个,涉及的耐药相关通路主要包括细菌趋药性、ABC转运蛋白、β-内酰胺抗性等;PRM成功定量到13个差异蛋白,且PRM验证结果与TMT定量结果一致。【结论】筛选出多个与大肠杆菌耐药性相关的差异表达蛋白和通路。

大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆的比较蛋白质组研究

大肠杆菌是奶牛乳房炎的主要病原微生物之一,为了分析大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆蛋白的表达变化,探索其防御机制。通过乳汁微生物培养的方法选择仅由大肠杆菌自然感染的隐性乳房炎奶牛。采用二维凝胶电泳技术分离大肠杆菌性乳房炎奶牛和临床健康奶牛的血浆蛋白和ProteoMiner试剂盒富集的中低丰度蛋白,凝胶用考马斯亮蓝G-250染色后,用图像分析软件检测血浆表达的差异蛋白点并用液质联用质谱鉴定。结果发现,大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆中有19个蛋白点的表达量发生改变,其中15个蛋白点鉴定为7种蛋白质。在大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆中结合珠蛋白、α1酸性糖蛋白和血清淀粉样蛋白A等蛋白的表达量增加。并用ELISA法测定血浆结合珠蛋白的结果也发现,大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆结合珠蛋白水平显著高于健康牛(P<0.01)。表明大肠杆菌感染造成了奶牛血浆蛋白的表达发生了变化,对这些表达变化蛋白的解析有利于探索机体的防御机制,同时为疾病的诊断和治疗提供科学依据。

大肠杆菌双杂交系统筛选与AMPKα2相互作用的蛋白质

目的利用大肠杆菌双杂交系统筛选脑组织中与大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-activated protein kinaseα2,AMPKα2)相互作用的蛋白质,以期进一步探讨AMPKα2在脑内的生物学功能及调节机制。方法以重组质粒pBT-AMPKα2作为诱饵,应用大肠杆菌双杂交系统筛选大鼠胎脑cDNA文库,并对结果进行生物信息学分析。结果筛选出与AMPKα2结合的蛋白7个,包括聚合泛素、热休克蛋白8(heat shock protein8,HSP8)、磷酸果糖激酶、细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COXⅠ)、人类白细胞抗原B关联性转录物3(HLA-B-associatedtranscript3,BAT3)异构体1、蛋白酪氨酸磷酸酶受体型D(protein tyrosine phosphatase receptor type D,Ptprd)、岛-脑蛋白1(islet-brain1,IB1)。结论寻找到了脑内与AMPKα2相互作用的7种蛋白:聚合泛素、HSP8、磷酸果糖激酶、COXⅠ、BAT3异构体1、Ptprd、IB1。

EcoPDB:高精度大肠杆菌蛋白质结构与对应基因序列数据集

高质量蛋白质结构及其对应基因序列数据是研究蛋白质折叠与蛋白质编码序列关系问题的基础 .通过查询SWISS PROT数据库中E .coli的蛋白质 ,得到不同数据库中的蛋白质结构与基因序列的交叉索引表 ,在此基础上 ,删除大量冗余及不可靠数据 ,最后得到一个高精度数据集E coPDB .该数据集共有 191个E .coli基因及其相应的精度好于 2 .5 的X射线衍射测定的PDB蛋白质结构数据 ,总残基数约 5.