应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的:应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法:应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序535IVVY538的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果:筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论:应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。

Ezrin的原核表达及与其相互作用蛋白的研究

目的体外筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。方法提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增Ezrin基因。将扩增得到的Ezrin基因片段和pET15b质粒转化E.coli DH5α,获得pET15b-Ezrin重组质粒,双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行Ni2+-NTA亲和层析和分子筛纯化后,行SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS/MS质谱分析和蛋白质印迹鉴定。裂解Panc-1细胞,获得总蛋白提取液,采用Pull-down方法体外筛选与Ezrin重组蛋白相互作用的蛋白,并对筛选出的目的蛋白进行双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定。结果RT-PCR扩增出的Ezrin基因片段(1761bp)与理论DNA表达片段大小一致,测序鉴定显示克隆的Ezrin基因序列与GenBank报道序列相符。SDS-PAGE、质谱分析和蛋白质印迹分析显示纯化后Ezrin重组蛋白相对分子质量为69400,与质谱分析的相对分子质量结果相符,为带有His-6标签的特异蛋白。双向凝胶电泳和质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的7种蛋白,其分别为RNA-binding motif protein39(RBM39)、Transgelin(TAGLN)、Albumin(ALBU)、Formin-1(FMN1)、Rho GTPases(RHGBA)、Tetratricopeptide repeat protein16 (TTC16)、Syntaxin-binding protein1(STXBP1)。结论在大肠杆菌中成功表达、纯化了Ezrin蛋白,并在体外成功筛选出可信的与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。

经典转化生长因子β/Smad信号和Wnt/β-catenin信号间的相互作用

TGF-β信号通路是调节细胞生长和分化的的重要通路,此外还参与纤维化疾病发生和肿瘤发生发展的调控。Wnt信号通路是调节胚胎发育和肿瘤侵袭转移的重要通路。近10年来研究表明,这两条通路在调节胚胎发育、纤维化疾病发生以及肿瘤的演进等过程中共同发挥着重要作用,两者之间存在着密切联系,这两条通路存在Smad、轴蛋白(Axin)、蓬乱蛋白(Dvl)和β-连环蛋白(β-catenin)几个典型的相互作用的交叉点。本文着重阐述经典的TGF-β信号通路和Wnt信号通路在这几个交叉点的相互作用模式,以更好地应对纤维化疾病和肿瘤的进展。

蛋白质功能预测方法概述

蛋白质是生物体内最必需也是最通用的大分子,对它们功能的认识对于科学领域和农业领域的发展有着至关重要的作用。随着后基因组时代的发展,NCBI数据库中迅速涌现出大量不明结构与功能的蛋白质序列,这些蛋白质序列甚至一跃成了研究的热点。近几十年来蛋白质功能预测的方法不断被完善。由最初的仅基于蛋白质序列或3D结构信息的方法衍生出更多的基于序列相似性、基于结构基序、基于相互作用网络等新方法,这些新型方法采用新的算法、新的研究思路和技术手段,力求得到准确性与普遍性并存,能够被广泛应用的蛋白质功能预测方法。本文综述了近年来蛋白质功能预测的方法,并将这些研究方法分类归纳,各自阐明了每类方法的优缺点。

TPR基序——一种介导蛋白质相互作用的结构域

TPR蛋白家族成员功能复杂,均含有TPR基序。该基序是一个含有34个氨基酸的重复序列,通常串行排列。通过形成特殊的空间结构,介导蛋白质的相互作用,并在一些重要的蛋白复合物形成中非常重要。本文拟就TPR基序的结构及功能作一简要综述。

瘢痕疙瘩分泌性卷曲相关蛋白2与骨母细胞特异性因子2的相互作用

目的验证分泌性卷曲相关蛋白2（SFRP2）与骨母细胞特异性因子2（OSF-2）的相互作用。方法构建能在哺乳动物细胞中表达带人膜联蛋白（HA）标签的OSF-2融合蛋白重组载体pCMV—HA—OSF-2，经酶切鉴定确认后，与Myc—SFRP2重组真核表达载体pCMV-HA-SFRP2单独或共转染人HK293细胞，利用免疫共沉淀技术及蛋白质印迹法验证OSF-2与SFRP2的相互作用。结果重组载体经酶切电泳后，显示近800bp处的条带为酶切后的目的片段SFRP2编码基因，近2500bp处的条带为酶切后目的基因OSF-2。表明pCMV-Myc-SFRP2和pCMV-HA—OSF-2均构建成功。HK293细胞单独转染pCMV—Myc—SFRP2或pCMV-HA-OSF-2后，未检测到HA—OSF-2的表达；当pCMV—Myc—SFRP2和pCMV—HA，OSF-2共转染后，经Myc抗体进行免疫沉淀可见HA—OSF-2表达。结论HA—OSF-2的重组载体能在哺乳动物细胞中表达，HA—OSF-2与SFRP2间存在相互作用。

人肺腺癌转移差异蛋白质生物信息学分析

目的 对无转移肺腺癌和有转移肺腺癌表达差异蛋白质进行生物信息学分析.方法 利用Cytoscape软件对前期发现无转移肺腺癌和有转移肺腺癌表达差异的20个蛋白质进行基因本体论（GO）功能富集分析和蛋白质相互作用网络构建.结果 20种肺腺癌转移差异表达蛋白质的主要生物学过程为葡萄糖分解和酒精分解等过程,主要分子功能为磷脂酶A2抑制剂活性和钙依赖的磷脂结合,蛋白质相互作用网络为包含245种不同蛋白质和230种不同蛋白质相互作用关系.结论 葡萄糖分解过程、酒精分解过程、磷脂酶A2抑制剂活性和钙依赖的磷脂结合及ACTB、ANXA1、ANXA2、ANXA3、VCP、NPM1、KRT1、SUMO4等关键蛋白质在人肺腺癌转移过程中发挥重要作用,为进一步研究提供线索.

磷酸化调控泛素单体与Rad23A/Ubiquilin-1中泛素结合域互作的检测

泛素(ubiquitin,Ub)是一种广泛存在、高度保守的信号蛋白质,它能够特异性识别成千上万种靶蛋白,以非共价方式行使不同的功能,其中包含蛋白质降解.Ubiquilin-1(Ubql-1)和Rad23A作为两种蛋白降解的转运因子,都包含有与泛素结合的结构域,被称为泛素结合域(ubiquitin-associated domain, UBA).2014年,泛素S65位磷酸化修饰的特异性激酶PINK1被发现,磷酸化使泛素在溶液中呈现舒展态与收缩态两种互相转换的构象.本文通过核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技术对UBA和磷酸化泛素之间的相互作用进行检测,观测磷酸化对UBA和泛素结合的影响.实验结果表明Rad23A-UBA2与Ubql-1 UBA都特异性的与磷酸化泛素的舒展态相互作用,但是磷酸化未改变泛素与UBA之间的亲和力.值得注意的是与Ubql-1 UBA相互作用时,磷酸化促进了泛素收缩态向舒展态的转换.

类细胞环境下蛋白质结构与功能的NMR研究

细胞环境是大多数蛋白质行使其功能的天然环境。在细胞环境中,大分子拥挤、限域、弱相互作用等普遍存在,已经有越来越多的研究表明这种复杂细胞环境会影响蛋白质的结构与功能。因此,在越接近天然的环境中研究蛋白质,越有可能揭示蛋白质功能的本质。蛋白质结构与功能的原位研究已是目前蛋白质科学中的前沿领域。核磁共振波谱技术是研究复杂环境中蛋白质结构与功能最具潜力的手段,它能提供原子分辨的蛋白质结构,动态与相互作用信息。本文总结了我们近几年利用核磁共振技术研究大分子拥挤、限域、以及原核E.coli细胞、非洲爪蟾卵母细胞中蛋白质结构与功能等方面取得的重要进展。

FHL2调控Id2功能活性的研究

目的:探讨FHL2对Id2蛋白功能的调控效应。方法:将E47、5xE-Box-Luc、pRL-SV40、Id2以及FHL2表达载体分别共转染MCF-7、293T以及SH-SY5Y细胞,双荧光素酶报告基因方法检测不同转染组细胞中的相对荧光素酶活性。结果:三个细胞系中E47均显著上调了报告基因的表达,Id2抑制了E47的转录激活活性,而FHL2通过与Id2相互作用显著消弱了Id2对E47功能的抑制效应。结论:通过相互作用FHL2抑制了Id2蛋白的功能活性,FHL2是一个新的Id2蛋白功能抑制子。

核转录因子C/EBPβ的研究进展

C/EBPβ是转录因子C/EBPs(CCAATenhancerbindingproteins)家族的重要成员,其C端具有高度保守的DNA结合域和二聚化功能域。它主要通过对靶细胞基因转录的调节,参与细胞增殖与分化、肿瘤发生与凋亡、机体炎症反应等重要生命活动;其功能受到蛋白酶降解、磷酸化、蛋白质相互作用等多种途径的调控。本文综述有关C/EBPβ的生物学功能及其调控机理近年来的一些研究进展。

circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3与糖尿病视网膜病变的相关性研究

目的探讨环状RNA(circRNA)-锌指蛋白532(ZNF532)、circRNA-同源域相互作用蛋白激酶3(HIPK3)与糖尿病视网膜病变(DR)的相关性。方法纳入109例DR患者(DR组)、110例单纯糖尿病患者(DM组)和65例健康体检志愿者(对照组)。实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达,酶联免疫吸附试验检测血清血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6水平。Pearson分析DR患者血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达与血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6水平相关性。单因素和多因素Logistic回归分析DR危险因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3诊断DR的价值。结果DR组血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达以及VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6水平高于DM组和对照组(P<0.05)。DR组血清circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达与VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6水平均呈正相关(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示高水平circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3及VEGF是糖尿病患者发生DR的独立危险因素(P<0.05)。三者诊断糖尿病患者发生DR的曲线下面积分别为0.736、0.740和0.864,联合诊断高于单独诊断(P<0.05)。结论糖尿病患者血清中circRNA-ZNF532、circRNA-HIPK3表达上调与DR发生有关,两者可以作为DR辅助诊断的潜在指标。

ARID1A在肝内胆管癌患者中的表达及与肿瘤微环境的关系

目的探讨AT丰富结合域(ARID1A)蛋白在肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)患者肿瘤中的表达情况及其与患者肿瘤微环境的相关性。方法回顾性分析2015年1月至2021年5月在北京大学人民医院行肝切除术的110例ICC患者的临床病理及生存情况,使用免疫组化染色测定肿瘤组织中ARID1A、细胞程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)表达及微环境中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)、分化簇8(cluster of differentiation 8,CD8)表达情况。结果27例患者肿瘤组织不表达ARID1A,肿瘤不表达ARID1A蛋白与肿瘤高PD-L1表达,微环境中高PD-1、CD8表达具有明显相关性(P<0.05)。多因素分析显示ARID1A表达情况、术前CEA水平、术前CA19-9水平、是否合并淋巴结转移、肿瘤数目是患者术后生存的独立危险因素。结论肿瘤不表达ARID1A提示着ICC患者的不良预后,ARID1A缺失表达的ICC肿瘤微环境中PD-L1、PD-1、CD8蛋白高表达,提示这类患者是免疫治疗的潜在获益人群。