蛋白质及多肽类药物的研究进展

20世纪70年代生物技术发生了巨大的变化,应用生物技术起点主要集中在最为活跃的研究领域——医学领域,它给生命科学的研究带来了一场革命。随着生物技术的高速发展,蛋白质类药物体现出了确切的药用价值,其成本低、成功率高、安全可靠,已成为医药产品中重要的组成部分。

白血病多药耐药相关蛋白质类研究进展

多药耐药（multidrug resistance,MDR）最常见的机制是凋亡耐受和过表达某些能将抗癌药物从细胞内泵出的膜蛋白。过表达ABC转运子（ΑTP-binding cassette transports）转运子等膜蛋白则导致泵耐药（pump resistance）,

姜黄素对人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR蛋白质双向电泳图谱的影响

目的探讨姜黄素处理对人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR蛋白质表达谱的影响。方法实验分两组,姜黄素处理组用25μmol/L的姜黄素作用于人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR 24h,对照组加入相应体积的生理盐水。应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离姜黄素处理组与对照组人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR的总蛋白,凝胶银染显色,采集凝胶图像,用PDQuest 8.0软件分析并比较两者之间差异表达的蛋白质。结果获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的HCT-8/VCR细胞系2-DE图谱,姜黄素处理组和对照组图像的平均蛋白质点数分别为1030±69和1070±96,两者的差异点共33个,姜黄素处理组有8个蛋白点表达上调,18个表达下调,2个在姜黄素处理组特异表达,5个在对照组特异表达。结论建立了经或不经姜黄素处理的人结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR的双向凝胶电泳图谱,识别了33个差异表达的蛋白质点,对这些差异蛋白点的进一步分析有助于研究姜黄素逆转结肠癌多药耐药的分子机制。

应用蛋白质组学技术研究HL-60细胞及其耐阿霉素细胞株的蛋白表达差异

目的比较人髓系白血病细胞株HL-60细胞和耐阿霉素的细胞(HL-60/ADR)的整体蛋白表达谱,以期获得人髓系白血病细胞的耐药相关蛋白。方法提取HL-60细胞和HL-60/ADR细胞的总蛋白,采用荧光差异显示的双向凝胶电泳技术(DIGE)比较分析差异表达蛋白;经胶内酶解,MALDI-TOF/TOF质谱分析,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息。结果经过初步筛选和质谱分析共获得16个具有统计学意义的表达差异蛋白点,其中13个在HL-60细胞中表达上调,3个表达下调。主要是代谢酶类、DNA修复、信号转导相关蛋白、细胞周期调节蛋白和细胞增殖与凋亡等相关的蛋白。结论根据人髓系白血病细胞株HL-60细胞和HL-60/ADR细胞的差异蛋白表达谱比较,筛选出耐药相关蛋白。

胃癌组织核转录因子κB p65蛋白表达与肿瘤多药耐药性的关系

目的分析胃癌组织中核转录因子κB(NF-κB)p65蛋白表达与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系,并探讨其意义。方法选取2013年1—12月在河北医科大学第四医院外三科手术切除并经病理证实的68例胃癌患者的肿瘤组织及癌旁组织。采用免疫组化(SP)法检测胃癌组织及癌旁组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表达;采用体外药物敏感实验(MTT法)检测胃癌组织细胞对氟尿嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂(L-OHP)、表阿霉素(e ADM)的体外化疗药物敏感性。结果胃癌组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2蛋白强表达率均高于癌旁组织,Bax蛋白强表达率低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析结果显示,胃癌组织NF-κB p65与P-gp蛋白表达呈正相关(rs=0.321,P=0.008),NF-κB p65与Bax蛋白表达呈负相关(rs=-0.333,P=0.006),NF-κB p65与Bcl-2蛋白表达无直线相关关系(rs=0.231,P=0.058)。在胃癌组织中,5-FU、PTX对NF-κB p65强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者,差异有统计学意义(P<0.05);5-FU、PTX、L-OHP对P-gp强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者,差异有统计学意义(P<0.05);5-FU、PTX、e ADM对Bcl-2强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者,差异有统计学意义(P<0.05);5-FU、L-OHP、e ADM对Bax强表达者肿瘤细胞抑制率高于弱表达者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌组织中NF-κB p65表达增高,其可能通过调控P-gp、Bax蛋白表达而参与胃癌MDR。

P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白在胃癌的表达与化疗敏感性的相关性研究

目的:探讨胃癌组织中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrugresis-tance-associatedprotein,MRP)的表达及对胃癌原代细胞培养体外化疗药物敏感性的影响。方法:应用免疫组化法检测P-gp及MRP在48例胃癌及癌旁组织的表达,同时通过胃癌原代细胞培养MTT药敏试验,检测胃癌对7种临床常用化疗药物的敏感性及耐药性,进一步分析药敏试验结果与P-gp、MRP表达的相关性。结果:在48例胃癌中,P-gp及MRP阳性率分别为41.7%、29.2%,共同表达率为25.0%。癌旁组织与癌组织的P-gp、MRP阳性表达率无显著差异。在顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、羟基喜树碱(HCPT)、甲氨蝶呤(MTX)中,ADM、VP-16、HCPT耐药组P-gp、MRP阳性表达及共表达率较敏感组显著升高。结论:胃癌组织P-gp、MRP表达可导致胃癌原发性耐药。P-gp、MRP介导的MDR是ADM、VP-16、HCPT耐药的重要因素。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在肝癌细胞7721中对多药耐药的调节作用

目的采用2种方法构建人肝癌多药耐药细胞模型,封闭其细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)(CD147)的表达,研究其生物学特性。探讨EMMPRIN在肝癌细胞中对多药耐药的作用。方法应用人肝癌细胞株7721,采用浓度梯度诱导法和高浓度阿霉素间接诱导法构建人肝癌多药耐药细胞模型(7721/Adm1和7721/Adm2细胞),应用RNAi技术封闭7721/Adm1和7721/Adm2细胞EMMPRIN的表达,构建封闭EMMPRIN的人肝癌多药耐药细胞7721/Adm1/RNAi和7721/Adm2/RNAi细胞。用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞技术检测EMMPRIN、细胞表面多药耐药基因(MDR-1)mRNA及其表达产物的表达水平。噻唑蓝(MTT)法检测上述各细胞的多药耐药性。结果 2种多药耐药模型可用于肝癌多药耐药研究。多药耐药细胞7721/Adm1和7721/Adm2中EMMPRIN,MDR-1的表达水平较7721细胞均升高,且增加了其对多种化疗药物的耐药性。而利用RNAi封闭EMMPRIN的7721/Adm1和7721/Adm2细胞可致MDR-1表达降低,增加了其对化疗药物的敏感性。结论 EMMPRIN是参与肝癌细胞7721多药耐药且为调节多药耐药的重要分子。

不同剂量亚砷酸钠染毒大鼠多药耐药相关蛋白2表达水平的变化

目的观察不同剂量亚砷酸钠染毒大鼠肝细胞膜转运蛋白——多药耐药相关蛋白2(multidrugresistance-associatedprotein2,MRP2)表达水平的变化及与砷代谢的关系。方法24只健康雄性Wistar大鼠随机分为4组:第1组为对照组,给予生理盐水;第2～4组为染砷组,分别给予4、10和20mg/kg体质量的亚砷酸钠溶液,隔天灌胃染毒1次,2周后将大鼠处死。原子吸收分光光度法测定胆汁、全血和肝组织中的总砷含量。蛋白印记法测定肝细胞膜上MRP2的改变。结果经方差分析检验,胆汁和肝脏中含砷量随着染砷剂量的增加而逐渐增加(P<0.05)。两两比较发现,3个染毒组的血砷与对照组之间差异有统计学意义,而3个染毒组间差异无统计学意义。随着染砷剂量增加,MRP2表达有增加的趋势,且MRP2表达量与胆汁含砷量呈正相关(r=0.986,P<0.05)。结论亚砷酸钠可以诱导MRP2的表达,随染砷剂量增加,MRP2表达量增加。MRP2在砷及其代谢产物的胆汁排泄过程中发挥了重要作用。

脑胶质瘤体外化疗药物敏感性试验与耐药基因蛋白表达的相关性研究

目的研究脑胶质瘤耐药相关基因蛋白的表达情况,分析其与化疗药物体外敏感性之间的相关性。方法采用组织培养药敏检测法测定50例脑胶质瘤标本对五种不同类型化疗药物:顺铂(cisplatin,DDP)、长春新碱(vincristine,VCR)、替尼泊甙(teniposide,VM26)、尼莫司汀(nimustine,ACNU)和替莫唑胺(temozolomide,TMZ)的体外敏感性(通过计算体外抑制率);同时在组织芯片平台上,运用免疫组织化学法检测耐药相关蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)、P-170、TopoⅡ、谷胱苷肽-S-转移酶π(GST-π)的表达,并用免疫组织化学法和原位杂交法检测P53蛋白及p53基因的表达。结果①ACNU体外抑制率与GST-π表达水平之间呈显著性负相关(r=-0.318,P<0.05)。②耐药相关蛋白GST-π与P-170、TopoⅡ表达水平之间呈显著性相关(r分别为0.317和-0.298,P<0.05)。③突变型P53蛋白与野生型p53mRNA之间呈显著性负相关(r=-0.806,P<0.001)。④突变型P53蛋白与TopoⅡ表达水平之间呈显著性相关(r=0.401,P<0.01)。结论肿瘤体外药敏试验结合耐药相关基因蛋白的检测,对于胶质瘤个体化化疗方案的制定及临床化疗疗效的预测等具有重要意义。

乳腺癌组织耐药相关蛋白的表达及其临床意义

目的:探讨乳腺癌组织耐药相关基因表达及其与临床病理学因素之间的关系。方法:应用流式细胞术检测多药耐药蛋白P-糖蛋白(P-gP)、谷胱苷肽-S-转移酶(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在64例乳腺癌组织中的表达情况,分析其与患者临床分期、年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、雌孕激素受体(ER、PR)表达状态等因素的关系及5种耐药基因间的相关性。结果:P-gp、GST-π、LRP、MGMT和MRP在原发性乳腺癌组织中均有一定水平表达,P-gp和GST-π的表达与腋窝淋巴结转移有关(P值分别为0.007和0.031),MG-MT的表达在年龄<50岁组明显升高,P=0.018。GST-π、MRP和MGMT的表达在肿瘤体积较大组中明显升高(P值分别为0.042、0.000和0.015),5种耐药基因的表达与ER、PR表达相关差异均无统计学意义,P>0.05。乳腺癌组织中各耐药基因之间存在共表达现象,P-gp和GST-π的表达及LRP与MRP的表达均存在正相关性(r=0.66,P=0.000;r=0.434,P=0.004)。结论:乳腺癌组织中耐药蛋白的表达与患者肿瘤体积、年龄、淋巴结转移状况有关,耐药蛋白高表达,均提示为乳腺癌的不良预后指标。乳腺癌组织中各耐药蛋白之间存在共表达现象。

多药耐药相关蛋白2:在肠道药物处置中的重要作用

多药耐药相关蛋白2(MRP2)是ATP结合盒转运蛋白超家族成员之一,是一种ATP依赖性有机阴离子转运蛋白。鉴于其广泛的底物专属性,MRP2在肠道药物处置中发挥着重要作用,包括肠吸收、肠分泌以及与肠道药物Ⅱ相代谢酶如谷胱甘肽-S-转移酶、UDP-葡萄糖醛酸转移酶及硫酸转移酶等的协同作用。此外,MRP2还影响着中药成分的肠吸收过程。

骨软组织肉瘤中耐药相关蛋白表达及与化疗耐药的相关性

目的:探讨4种耐药相关蛋白-P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)和多药耐药相关蛋白(MRP)在骨肉瘤细胞株Saos2和U2OS以及34例骨软组织肉瘤的表达及与化疗耐药的关系。方法:应用流式细胞术(FCM)检测蛋白表达;MTT法评估化疗耐药。结果:Saos2细胞耐药相关蛋白的表达低于U2OS,阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素(MMC)、氮烯咪胺(DTIC)和长春新碱(VCR)的敏感性高于U2OS。两细胞株经1/5半数抑制浓度(IC50)的ADM和DDP分别处理24 h后,GST-π增幅达33%-43%。34例患者对ADM、DDP、5-Fu、MMC、DTIC、VCR和MTX的不敏感率分别为41.18%、17.65%、47.06%、50.00%、76.47%、61.76%和52.94%。肿瘤组织P-gp、GST-π、LRP和MRP表达分别为1.54、2.58、1.91和1.86。相关分析显示,P-gp表达与ADM耐药呈正相关(r=0.485,P<0.01),GST-π表达与ADM、DDP、5-Fu、MMC耐药呈正相关(r分别为0.402、0.458、0.364和0.500,P值分别为<0.05、<0.01、<0.05和<0.01)。耐药相关蛋白在不同性别、不同年龄、不同病理类型、不同肿瘤大小患者间的表达差异均无显著(P>0.05)。经术前化疗的患者GST-π表达显著升高,且随访复发患者术前GST-π表达显著高于无复发患者(P<0.05)。结论:骨软组织肉瘤患者耐药相关蛋白表达及化疗敏感性存在显著个体差异。化疗可引起GST-π表达上调。原发GST-π高表达是骨软组织肉瘤耐药的主要机制并与预后有关。

多药耐药基因相关蛋白在原发性肝癌中的表达及意义

目的探讨原发性肝细胞癌中耐药基因相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、DNA拓扑异构酶-Ⅱ(Topo-Ⅱ)、谷胱苷肽-S-转移酶(GST-π)的表达及其意义。方法应用免疫组织化学方法S-P法检测49例原发性肝癌组织、14例肝硬化组织及13例正常肝组织中P-gp、Topo-II、GST-π的表达。结果肝癌组三者表达均高于肝硬化组及正常组(P<0.05),肝硬化组与正常组之间两者表达差异无统计学意义。P-gp表达与肿瘤Edmondson分级呈负相关;Topo-II表达则与Edmondson分级和转移呈正相关。P-gp、Topo-II表达呈负相关。结论联合检测肝癌耐药基因相关蛋白P-gp、Topo-II、GST-π的表达有助于临床判断肝癌对化疗的敏感性及预后。

缺氧诱导因子1α、多药耐药相关蛋白1在脊索瘤中的表达及其临床意义

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白、多药耐药相关蛋白1(MRP1)在脊索瘤中的表达水平及其与脊索瘤病理特征和放化疗抵抗之间的关系。方法收集2000年1月-2008年12月接受手术治疗的50例脊索瘤患者的肿瘤组织石蜡标本,另取15例骨软骨瘤标本作为对照。50例脊索瘤患者中男35例,女15例;年龄17～77岁,平均53.3岁;原发病例26例,复发病例24例;病理类型包括普通型48例,去分化型1例,外周型1例。采用免疫组化Envision法检测HIF-1α、MRP1蛋白表达情况,分析其与放化疗抵抗的关系,并探讨HIF-1α、MRP1表达与脊索瘤临床病理特征的关系。结果50例脊索瘤组织HIF-1α、MRP1的阳性表达率分别为80%和74%,均明显高于骨软骨瘤组织(分别为20%和27%,P<0.01)。相关性分析显示,脊索瘤组织中HIF-1α与MRP1的表达呈正相关关系(r=0.80,P<0.01)。脊索瘤组织中HIF-1α、MRP1的表达水平与患者性别、年龄、发病次数及肿瘤大小、部位、分化程度、分期、淋巴结转移均无明显关系。结论脊索瘤组织中HIF-1α和MRP1表达明显增高,且两者表达水平呈正相关,其过度表达可能在脊索瘤的放化疗抵抗中具有重要作用。

84株广泛耐药结核分枝杆菌对新型氟喹诺酮类药物的耐药情况分析

目的研究广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株对新型氟喹诺酮类药物的耐药特征以及氟喹诺酮类药物耐药相关基因突变的特点。方法选取2012年4月至2014年4月在北京胸科医院住院治疗的84例广泛耐药结核病患者的临床分离菌株，应用微孔板阿尔玛蓝显色法（micro—plate alamar blue assay，MABA）检测菌株对左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），所有菌株都进行了gyrA基因和gyrB基因的耐药决定区（QRDR）的序列测定。结果84株广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株经MABA检测，分别以1μg／ml、2μg／ml、1μg／ml作为耐药判读标准，左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星3种氟喹诺酮类药物的耐药率分别是88．1％（74／84）、44．0％（37／84）、61．9％（52／84）。89．3％（75／84）的临床分离株发生了gyrA基因耐药决定区突变，其中以第94位点突变最为常见，Asp94Gly突变菌株的MIC值较高，而所有菌株的gryB基因均为野生型。结论广泛耐药结核分枝杆菌对新型氟喹诺酮类药物耐药形势严峻，耐药基因突变形式以gyrA基因突变为主，第94位点的Asp94Gly突变可能和高水平耐药有关。

结肠癌中多药耐药相关蛋白和肺耐药蛋白的表达

目的:探讨结肠癌中多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药蛋白(LRP)的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测51例结肠癌和32例癌旁相对正常结肠中MRP和LRP的表达情况。结果:51例结肠癌中MRP的阳性率为41.18％(21/51),32例癌旁相对正常结肠中MRP的阳性率为18.75％(6/32),两组比较差异有显著性(P<0.05)。LRP的表达与结肠腺癌的分化程度相关,高分化腺癌的阳性率为90.00％(9/10),中分化腺癌的阳性率为79.66％(23/29),高于低分化腺癌20.00％(1/5)的阳性率,差异有显著性(P<0.05)。结肠癌中MRP与LRP的表达存在相关性(P<0.05)。结论:结肠癌中MRP和LRP均为高表达,两者均可能是结肠癌原发性多药耐药的重要机制,且两者可能有协同作用。临床上检测这2种蛋白的表达,有助于对化疗药物的选择。

胃癌多药耐药相关蛋白表达的临床分析

背景:胃癌对化疗药物原发或继发不敏感可致肿瘤多药耐药。目的:探讨胃癌组织中多药耐药相关蛋白P糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)-π、Bcl-xL的表达及其意义。方法:收集胃癌手术标本113例,每例标本选取肿瘤组织、距病灶5 cm以上的正常胃黏膜组织各1块。以免疫组化法检测多药耐药相关蛋白P-gp、GST-π、Bcl-xL的定位和表达,并与胃癌主要临床病理特征行相关性分析。结果:胃癌组织的P-gp、GST-π、Bcl-xL阳性表达率(48.7%对5.3%,P<0.05;62.8%对25.7%,P<0.05;83.2%对23.0%,P<0.05)和高表达率(18.6%对0%,P<0.05;23.9%对0%,P<0.05;71.7%对0%,P<0.05)均明显高于正常胃黏膜组织,胃癌组织P-gp、GST-π、Bcl-xL三者间表达呈正相关(P<0.05)。胃癌组织GST-π、Bcl-xL阳性表达与肿瘤组织分化程度呈正相关(P<0.05).胃癌组织P-gp、GST-π、Bcl-xL表达与患者的性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移和临床分期均不相关(P>0.05)。结论:胃癌组织多药耐药相关蛋白P-gp、GST-π、Bcl-xL表达与胃癌的发生相关,且肿瘤组织GST-π、Bcl-xL表达与分化程度呈正相关,可作为判断胃癌患者预后的指标。

多药耐药相关蛋白、P53蛋白在乳腺癌中的表达

目的:探讨人乳腺癌组织中多药耐药相关蛋白(MRP)与P53蛋白的表达及关系。方法:采用免疫组化方法检测43例手术切除的乳腺癌标本中MRP与P53蛋白的表达,17例乳腺纤维腺瘤标本作为对照。结果:乳腺癌组织中MRP、P53蛋白的阳性率显著高于乳腺纤维腺瘤组(P<0.05);MRP的表达水平与年龄、月经状况、肿瘤大小、有无淋巴结转移、病理类型及TNM分期无关(P>0.05);P53蛋白的表达在有淋巴结转移时显著高于无淋巴结转移时,与年龄、月经状况、肿瘤大小、病理类型及TNM分期无关(P>0.05);MRP的阳性表达率与P53蛋白表达高低呈正相关(r=0.396)。结论:MRP表达程度不受乳腺癌病程发展的影响,P53蛋白与乳腺癌的发生、发展有关,对评估患者预后可能具有重要意义,P53蛋白对乳腺癌中MRP的表达可能起调控作用。

多药耐药相关蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达

目的探讨多药耐药基因产物P-糖蛋白(P-gp)、拓扑异构酶(TOPOⅡ)、谷胱甘肽转移酶(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)在乳腺浸润性导管癌中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化SP法,对80例乳腺浸润性导管癌的主要耐药指标P-gp、TOPOⅡ、GST-π、LRP进行检测,并分析其与临床病理特征之间的关系。结果P-gp、TOPOⅡ、GST-π、LRP在乳腺浸润性导管癌的阳性表达率分别为40%、55%、65%、80%,P-gp、TOPOⅡ、GST-π、LRP在乳腺浸润性导管癌的表达无相关性。结论联合检测LRP、GST-π、TOPOⅡ、LRP对乳癌化疗药物的选择具有指导作用,对预后的判断有参考价值。