微生物宏蛋白质组从样品处理、数据采集到数据分析

微生物与人体疾病、健康密切相关,如何理解微生物群落的组成及其发挥的功能是一大亟需研究的问题。近年来,宏蛋白质组学已经成为研究微生物组成与功能的重要技术手段。然而,由于微生物群落样本的复杂性与高度异质性,样品处理、质谱数据采集与数据分析成为宏蛋白质组目前面临的三大挑战。在宏蛋白质组分析中往往需要针对不同类型的样品进行前处理优化,采取不同的微生物分离富集、提取和裂解方案。与单一物种蛋白质组相类似,宏蛋白质组学中的质谱数据采集模式有数据依赖性采集(data-dependent acquisition,DDA)模式和数据非依赖性采集(data-independent acquisition,DIA)模式。DIA数据采集模式可以完整地采集样品的肽段信息,具有很强的发展潜力。但是由于宏蛋白质组样品的复杂性,其DIA数据解析已成为阻碍宏蛋白质组深度覆盖的一大难题。在数据解析方面,最重要的步骤在于蛋白质序列数据库的构建。数据库的大小和完整性不仅对鉴定数量有很大影响,还会影响物种和功能水平上的分析。目前宏蛋白质组数据库构建的金标准是基于宏基因组的蛋白质序列数据库。同时,基于迭代搜库的公共数据库过滤方法也已被证明具有很强的实用价值。从具体的数据解析策略角度,以肽段为中心的DIA数据解析方法占据了绝对的主流。随着深度学习和人工智能的发展,其会极大地推动宏蛋白质组数据解析的准确度、覆盖度与分析速度。在下游生物信息学分析方面,近年来开发了一系列注释工具,可以在蛋白水平、肽段水平、基因水平上进行物种注释来获得微生物群落组成。与其他组学方法相比,微生物群落的功能分析是宏蛋白质组学的一个独特特征。宏蛋白质组已经成为微生物群落多组学分析中的重要组成部分,并且仍在覆盖深度、检测灵敏度、数据解析完整度等方面具有很大的发展潜力。

基于半胱氨酸氧化修饰蛋白质组学研究高压处理对冷藏滩羊肉应力松弛特性的影响

通过半胱氨酸(Cys)氧化修饰蛋白质组学探究不同高压处理(200 MPa/500 MPa、18℃、15 min)滩羊(4℃冷藏1、3、7 d)肌肉蛋白半胱氨酸的氧化修饰与应力松弛特性之间的相关性。结果表明:200 MPa和500 MPa高压处理的肌肉硬度和弹性显著高于对照(NT)组(P<0.05);高压处理组应力松弛特性指标普遍高于NT组,贮藏期间,500 MPa高压处理组羰基含量显著高于200 MPa高压处理组,而总巯基含量显著低于200 MPa高压处理组(P<0.05);半胱氨酸氧化修饰蛋白质组学分析结果显示,3组样本中共鉴定出388个显著差异氧化位点(significantly differential oxidation sites,SDOS),其中,15个SDOS与至少1个应力松弛特性指标呈显著相关性(P<0.05、P<0.01),这些位点涉及肌联蛋白(Cys32705、Cys29171、Cys26405、Cys32358)、伴肌动蛋白(Cys5628)、肌球蛋白结合蛋白H(Cys481)、肌球蛋白重链8(Cys403)、膜联蛋白(Cys292)、肌球蛋白重链11(Cys701)、L-乳酸脱氢酶(Cys315)、糖原磷酸化酶(Cys496)、磷酸葡萄糖变位酶1(Cys407、Cys134)、丙酮酸激酶(Cys510)及钙转运ATP酶(Cys651)。综上所述,高压处理可诱导结构蛋白的部分氧化位点发生氧化修饰,使蛋白变性和聚集,进而降低蛋白本身的降解程度,诱导滩羊肉贮藏期间的硬度增加。

样品前处理对测定含果粒酸奶中蛋白质的影响

[目的]探讨样品前处理对测定含果粒酸奶中蛋白质结果的影响。[方法]使用不同型号、不同参数的捣碎机和不同规格的料理杯,对含果粒酸奶进行粉碎,测定同一批次样品结果,进行数据比对。[结果]使用粉碎设备时,空气进入会使含果粒酸奶粉碎后产生大量气泡,导致蛋白质结果偏高。[结论]本文所用方法可避免气泡干扰因素,快速、有效测定含果粒酸奶中蛋白质含量。

基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理方法

本文建立了一种基于强阳离子交换填料/强阴离子交换填料(SCX/SAX)混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理方法.本工作将前期已发展的离心式集成化蛋白质组学样品前处理技术SISPROT中的SCX填料替换成SCX和SAX混合填料,以溶菌酶和牛血清白蛋白为模型蛋白,研究了3种pH(3,7.4,12)条件下蛋白质在SCX/SAX混合填料上的保留行为;应用BCA方法对SCX/SAX混合填料的比例进行了优化,并应用SDS-PAGE法对酶解步骤中pH变化引起的蛋白质丢失情况进行了系统的考察.实验结果发现,在pH 7.4条件下,质量比为1:1的SCX/SAX混合填料的富集效率最佳,蛋白质富集容量为180μg,是SCX填料富集容量的两倍左右;且酶解步骤的pH变化过程不会影响蛋白质在SCX/SAX混合填料上的保留.最后应用改进的SISPROT方法对少量肠癌组织样品进行了集成化蛋白质组学样品前处理和分析,并与传统的基于SCX填料的SISPROT方法进行了对比研究.结果表明,蛋白质鉴定量、特异性肽段数量和肽段谱图匹配数量均与基于SCX填料的SISPROT技术相当,证实了该方法作为蛋白质反应器的可靠性.鉴于该方法可以实现在生理pH条件下进行样品前处理,且显著提高了上样容量和减少了样品损失,该方法有望成为一种更为通用的集成化蛋白质组学样品前处理技术.

蛋白质组学样品处理方法研究进展

蛋白质组学研究已经成为后基因组时代的研究热点,是生命科学研究领域又一个新的突破口。以双向凝胶电泳为主的蛋白质分离技术以及基于生物质谱的蛋白质鉴定技术是目前该领域主要研究技术手段。在双向凝胶电泳蛋白分离和蛋白质谱鉴定中,样品处理影响甚至决定着蛋白分离效果和鉴定结果。因此有效的样品处理技术是获得真实、可靠实验数据的关键,在比较蛋白质组学研究中样品处理尤为重要。本文针对双向电泳前的蛋白质样品处理及质谱鉴定前的样品处理技术的研究进展作以综述。

尿液蛋白质组学中样品前期处理方法的研究进展

尿液是血液经肾小球滤过，肾小管和集合管重吸收、排泻及分泌产生的终末代谢产物，其组成与性状可反映整个泌尿系统的状况。尤其是尿液中蛋白质种类和数量的变化携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的各种信息，而尿液蛋白质组学是诠释尿液蛋白所携带信息的最有效方法之一，而且此研究可以发现体内很多疾病的生物标志，例如膀胱癌和肾炎等。然而尿液中的盐浓度高，代谢废物多，还有很多低浓度的复合物，复杂的组成成分大大增加了尿液蛋白质组学的研究难度。因此，尿液样品的前期处理在尿液蛋白质组学分析和疾病分析过程中是一个相当重要的环节。本文着重阐述近年来国内外尿液蛋白质组学样品的前期处理方法以及各方法的比较。

从样品前处理到质谱分析的全面自动化：蛋白质组学全自动解决方案

纳升二维高效液相-自动点样板-基质辅助激光解离飞行时间质谱NANO-2D-HPLC-AccuSpot-AXIMA PERFORMANCE Nano-2D—HPLC：岛津的Nano-2D—HPLC可以实现低至300nl／min的流速，

吡那地尔后处理大鼠缺血再灌注损伤心肌线粒体的蛋白质组学研究

目的:运用蛋白质组学研究方法探讨吡那地尔后处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用。方法:建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型,随机分为吡那地尔后处理组(Pina组)和缺血再灌注损伤组(I/R组),每组9只。提取心肌线粒体蛋白质行双向凝胶电泳,应用质谱鉴定差异大于2倍的蛋白质点。结果:Pina组与I/R组比较,共发现7个差异蛋白质:Pina组NADH脱氢酶1α亚复合体10亚基(NDUFA10)﹑NADH脱氢酶铁硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脱氢酶黄素蛋白2(NDUFV2)表达低于I/R组;Pina组异柠檬酸脱氢酶α亚基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰辅酶A异构酶(ECH1)表达高于I/R组;另有2个蛋白质点均被鉴定为ATP合酶δ亚基,一个蛋白质点表达升高,而另一个表达降低。结论:吡那地尔后处理可能抑制了复合体Ⅰ的亚基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代偿性增加,但促进了IDHA和ECH1表达并引发了ATP合酶δ亚基发生磷酸化,这些改变可能均与吡那地尔后处理保护心肌的作用有关。

样品前处理对牛精子全蛋白质组鉴定的影响

本文主要分析样品前处理对牛精子全蛋白质组鉴定的影响,文中对5种不同的蛋白质提取液和3种不同的酶解方法进行了系统地分析比较.5种蛋白质提取液:溶液BS(4%SDS,0.1mol/L Tris-HCl,0.1mol/L DTT);溶液BU(8mol/L Urea,0.1mol/L Tris-HCl);溶液BT(7mol/L Urea,2mol/L Thiourea,0.1mol/L Tris-HCl,0.4%Chaps);溶液BR(购自Thermo,货号89901);溶液BD(2%SDC,50mmol/L NH4HCO3,25mmol/L NaCl).3种酶解方法:溶液内酶解、胶内酶解以及膜上酶解(FASP).实验结果显示:牛精子蛋白质提取能力BS最强,BU最弱;BT、BR以及BD相当.BS-FASP不适用于牛精子蛋白质组学研究.胶内酶解鉴定到的蛋白质均多于FASP法,但是胶内酶解操作过程复杂繁琐,耗时长.基于BD的溶液内酶解法鉴定到的蛋白质数量最多,膜蛋白提取鉴定能力较强,且操作时间最短,是较为理想的方法.

蛋白质组学技术前沿进展

蛋白质组学是以生物体系整体蛋白质为研究对象的新的研究领域,已经成为后基因时代中生命科学最重要研究方向之一。近年来,蛋白质组学研究取得了令人鼓舞的进展,一系列新技术与新方法得到了快速的发展。本文总结了2013年以来蛋白质组学研究的有关新技术,并对其发展进行了展望。

过滤器辅助样品前处理法测定乳脂肪球膜蛋白质的研究

牛乳是世界上消费最广泛的乳类,并为消费者提供必需的营养物质。牛乳包括蛋白质,脂肪,糖类,维生素和矿物质。蛋白质是牛乳的重要组成部分,包括酪蛋白、乳清蛋白及乳脂肪球膜蛋白质。牛乳乳脂肪球被乳脂肪球膜覆盖,乳脂肪球膜是一个含有3层膜的膜结构,其上附着或者包含蛋白质。近些年来,对于乳中蛋白质的鉴定成为新的研究热点。随着蛋白质组学技术的发展,鉴定出的蛋白质的种类和数量都在增加。但是由于乳脂肪球膜的特殊性质,在牛乳乳脂肪球膜蛋白质的鉴定中,缺乏方便快捷及效果好的方法。作者运用过滤器辅助样品前处理法(FASP)结合纳升液相质谱(NanoLC-MS/MS)测定牛乳乳脂肪球膜蛋白质的种类和数量,共鉴别出169种蛋白质,是目前鉴别数量最大的一种方法。此方法的建立为今后乳脂肪球膜蛋白质研究领域提供一种方便快捷准确的试验工具。

杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的比较蛋白质组学分析

目的应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况。方法分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶图像以PDQuest1.0软件分析,并对主要差异表达蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的前鞭毛体与纯培养的无鞭毛体总蛋白经双向电泳分离后均可获近700个蛋白点,其中超过90%的蛋白点的分布和相对强度基本一致。与前鞭毛体比较,6个蛋白点在无鞭毛体蛋白中明显高表达,3个蛋白点低表达。6个明显高表达的蛋白点中有5个为已知功能蛋白,分别为Reiske铁硫蛋白前体、α微管蛋白、过氧化物酶1、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶前体和甘露糖-1-磷酸瓜氨酸转移酶;3个低表达的蛋白点中有2个为已知功能蛋白,分别为热休克蛋白70和β微管蛋白。这些差异调节表达蛋白与碳水化合物/能量代谢,应激反应,细胞膜和细胞骨架形成相关。结论前鞭毛体与无鞭毛体蛋白质的表达存在差异。

蛋白质组学揭示滩羊宰后成熟过程中风味前体物质的变化机理

为探讨宰后滩羊肉成熟过程中风味前体物质变化的机理,采用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)结合多维液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术研究滩羊背最长肌在各成熟时间点(0、4 d和8 d)的蛋白质组学变化情况。结果表明:滩羊肉不同成熟期差异表达蛋白主要包括代谢酶、结构蛋白和应激蛋白。随着宰后成熟的进行,代谢酶中磷酸丙糖异构酶、烯醇酶3、L-乳酸脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶1和丙酮酸激酶(与风味相关的关键代谢物调控酶)在成熟0~4 d时活性上调且变化较明显;而肌钙蛋白C1、肌钙蛋白T3、肌球蛋白轻链2、肌球蛋白轻链1、原肌球蛋白3和热休克蛋白70的表达量在成熟0~4 d时上调,在成熟4~8 d时下调较明显。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测滩羊肉中差异表达蛋白在mRNA转录水平上的基因相对表达量,宰后成熟过程中有4个差异表达蛋白在0~4 d和4~8 d时蛋白水平和mRNA转录水平的表达模式一致,分别为2个代谢酶(L-乳酸脱氢酶和磷酸丙糖异构酶)和2个结构蛋白(肌球蛋白轻链2和肌动蛋白α1)。综上,宰后滩羊肉成熟过程中代谢酶的调控、结构蛋白的降解和应激蛋白的防护共同对风味前体物质的变化起调控作用。

乳脂合成前体对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白质组学影响

向奶牛乳腺上皮细胞中添加β-羟基丁酸钠,利用双向电泳技术进行细胞亚细胞蛋白质组学方面的研究。结果表明,β-羟基丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白表达有显著影响。Imagemaster6.0软件分析出4个表达上调的蛋白点,鉴定分别是ENO1、α-glucosidase、plastin3和ARPC2。通过实时荧光PCR检测以上蛋白在mRNA水平的表达差异,结果均有不同程度的提高,其中以ENO1、α-glucosidase及Arpc2提高显著(P<0.05)。研究所筛选出的蛋白,将有助于进一步揭示奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳机制。

肺脏缺血预处理的蛋白质组学研究

目的 研究大鼠肺组织缺血预处理（IP）的蛋白质组变化。方法 20只SD大鼠，随机分为预处理组和对照组，每组10只。常规开胸后建立左上肺缺血再灌注模型，全部大鼠均遭受了缺血再灌注损伤（IRI），但预处理组在缺血再灌注前给予IP干预，对所有样本总蛋白质进行二维凝胶电泳分离，差异表达的蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析后Mascot软件搜索SWISS—PROT和NCBI数据库进行鉴定。结果 本研究建立了分辨率较高、重复性较好的鼠肺缺血再灌注损伤的双向凝胶电泳参考图谱，45个蛋白质点表达存在差异，其中包括巯基特异性抗氧化荆（TSA）和6个热休克蛋白家族在内的30个蛋白质点得到了鉴定。结论 蛋白质组学是研究IRI和IP肺脏保护机制的很有前途的工具。TSA在IP对肺脏IRI的保护机制中起重要作用。

定量蛋白质组学在果蔬采后商品化处理中的研究现状及进展

果蔬采后商品化处理涉及成熟衰老等多种生理和生化反应,利用高通量蛋白质组学技术对蛋白质进行定性和定量分析,识别果蔬成熟衰老过程中重要的蛋白质及其功能,能够对果实成熟衰老、抗逆性、致敏性、外源处理调控机制等进行深入研究。本文综述了定量蛋白质组学技术在果蔬采后商品化处理所涉及的生理生化过程及外源调控机制中的研究现状及进展,对果蔬采后商品化处理中保质保鲜研究具有重要指导意义。

基于两种预处理方法的白酒酒醅微生物宏蛋白质组学比较

分别采用离心-超声波破碎法(centrifugation-ultrasonic disruption,C-UD)和液氮研磨-超声波破碎法(liquid nitrogen grinding-ultrasonic disruption,LNG-UD)预处理浓香型白酒酒醅样品,采用Tris/酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法提取微生物蛋白质,利用非标记定量蛋白质组学技术比较两种预处理法获得的酒醅微生物群落结构差异。结果表明:两种预处理法提取的酒醅蛋白质含量差异不显著,但C-UD处理十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白条带数量更丰富且清晰。基于C-UD法获得的酒醅肽段及蛋白质数量高于LNG-UD法,且蛋白质鉴定结果的评分较高。两种预处理法获得的酒醅微生物种类及其群落结构有一定差异,且两者均与同一酒醅样品的基因组扩增子测序结果存在差异,提示整合多组学研究的必要性。研究结果有助于进一步优化酒醅微生物蛋白质的提取方法,为酿酒微生物宏蛋白质组学的深入研究奠定一定基础。

肽组学样品前处理方法与技术进展

肽组学作为蛋白质组学研究领域的一个重要分支,在生物标志物发现、疾病早期诊断、生物制药等领域有着广阔的应用前景。在肽组学研究过程中,样品前处理是首要环节。本文对肽组学样品前处理方法与技术进行了综述,内容涉及超滤技术、有机溶剂沉淀方法、固相萃取技术等。样品中大量高丰度蛋白质的存在是肽组学发展面临的最大挑战,因此迫切需要发展快速、有效、高通量、自动化的样品前处理方法和技术。

蛋白质组学研究相关技术及其在生物医学研究中的应用

蛋白质组学是以生物体系整体蛋白质为研究对象的新的研究领域 。

代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱-质谱分析方法研究

采用快速高分辨液相色谱-质谱联用技术,对代谢组学研究中血浆样品的前处理方法进行了考察及优化,建立了用于血浆中小分子代谢物分析的前处理方法。通过考察有机溶剂沉淀蛋白(不同溶剂系统)和固相萃取(Solid phase extraction,SPE)两种方法对血浆中蛋白质去除程度及16个代表性化合物的提取效果,确定采用乙腈沉淀蛋白法;进一步对乙腈沉淀蛋白法进行了细致的优化,确定使用3倍体积的冷藏乙腈慢速沉淀可以达到最佳的处理效果。对血浆中10种代表性化合物进行了方法学考察,结果表明,本方法重现性、精密度及样品冻融稳定性均良好。对穿插在检测序列中的生物质控样本检测结果进行主成分分析(Principal componentanalysis,PCA),证明本方法在代谢组学研究中的可重复性及获得的数据的可靠性良好,适用于代谢组学研究。