细菌蛋白质Tat转运系统的研究进展

蛋白质Tat转运系统不同于细菌中普遍存在的Sec转运系统 ,而与植物叶绿体中蛋白质转运的ΔpH依赖系统相似 .通过Tat系统转运的蛋白质底物含有特征性的双精氨酸保守序列核心S/T R R x F L K的信号肽 ,其h区的疏水性低 ,c区有由高赖氨酸、高精氨酸构成的避开Sec系统信号 ,信号肽和成熟蛋白质的组成对蛋白质的转运都有影响 .TatA、TatB、TatC和TatE四种蛋白质参与了大肠杆菌的Tat转运系统 .被转运的底物蛋白质绝大多数为与细菌厌氧呼吸有关的含氧化还原辅因子的酶 ,并以折叠形式转运 .

TAT介导的金属硫蛋白的穿膜效应及对细胞氧化损伤的修复作用

人类免疫缺陷病毒反式激活因子(human immunodeficiency virus transactivator,TAT)蛋白质转导肽是HIV-1编码的反式转录激活因子,富含碱性氨基酸序列,能够高效介导多种外源生物大分子通过多种膜性结构,例如细胞质膜和血脑屏障等。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质,在维持生物体内金属含量动态平衡、重金属解毒以及防御氧化应激中均发挥重要作用。本研究通过基因重组技术制备由TAT介导的能跨膜进入细胞的重组融合蛋白质TAT-MT,使其进入细胞,高效发挥抗氧化损伤效应。通过体外抗氧化实验测定TAT-MT的体外羟自由基清除率及总抗氧化能力;免疫荧光技术检测其穿膜活性;MTT法研究其对H2O2诱导的293T细胞氧化损伤的修复作用。结果显示,通过长引物PCR技术在目的基因5′-端加入TAT序列,成功构建原核表达载体pET28a-TAT-MT;通过TAT标签的引入显著增加了MT的可溶性表达;进一步通过表达条件的优化成功获得了TAT-MT的高效可溶性表达;采用亲和层析方法对重组蛋白质进行了分离纯化;免疫荧光检测显示,重组蛋白质可以高效进入细胞;体外抗氧化结果显示,当TAT-MT浓度为100μmol/L时,羟自由基清除率达到94.87%±5.18%,说明TAT-MT具有较强的清除羟自由基的能力;MTT结果表明,重组蛋白质对H2O2诱导的293T细胞氧化损伤具有显著的(P<0.05)修复作用。本研究为MT的规模化制备及进一步开发其在生物医药、食品保健及化妆品领域的应用奠定了基础。

大肠杆菌Tat转运酶的研究进展

TatA、TatB和TatC是大肠杆菌Tat转运酶的组成成分。研究表明各Tat蛋白具有不同的功能区域,TatA和TatB蛋白功能重要的位点位于N末端的穿膜片断、其后的双极性α-螺旋和铰链区。TatC的序列保守性低,N末端穿膜片断和位于胞质内的第一环区对转运是必需的。Tat转运酶各成分相互结合成复合物形式并相互依赖。TatA在细胞中高表达并自身聚合形成数量不等的同聚物,具有稳定TatBC复合物的作用,TatB有稳定TatC的功能,TatB和TatC两者结合形成二聚体。实验表明,TatA复合物形成转运通道,TatBC复合物通过TatC蛋白识别底物的信号肽并与底物结合,再在TatB介导下与TatA复合物结合形成具有活性的转运酶。