利用蛋白转导技术将α-烯醇化酶导入心肌细胞的实验研究

目的探讨将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞的可行性,为后续的蛋白功能研究奠定基础。方法原代培养WKY乳鼠心肌细胞,将纯化的α-烯醇化酶与蛋白转导载体Charoit共孵育后转染心肌细胞,同时设置阳性对照β-半乳糖苷酶转染组,光镜下计数转染阳性细胞的百分率;蛋白免疫印迹检测细胞总蛋白中α-烯醇化酶的表达;荧光共聚焦显微镜下观察α-烯醇化酶的亚细胞定位。结果Charoit能够将外源蛋白成功导入原代培养的心肌细胞中,光镜下可见β-半乳糖苷酶的导入效率约为81%,Western blot结果表明外源α-烯醇化酶成功导入了心肌细胞,免疫荧光显示导入的外源α-烯醇化酶与内源α-烯醇化酶相似,主要定位于胞浆。结论利用Charoit介导的蛋白转导技术能够成功将外源α-烯醇化酶导入心肌细胞。

蛋白转导技术的研究进展及其在神经保护中的应用

最新研究表明,一些蛋白序列可以以一种非细胞内吞的方式透过细胞膜进入细胞浆甚至细胞核内,其透膜效率不受与其所耦连的蛋白质或核酸等大分子的影响。这类透膜的蛋白序列不仅能够透过血脑屏障,而且与其他类似技术相比具有透膜能力强、毒性低、细胞类型选择性小等很多优势,特别是对于神经元同样具有明显的透膜能力,故可用于抑制神经系统疾病中由于各种原因所导致的神经元损伤。

神经元保护蛋白TAT-Bcl-XL的体外高效表达及其功能的初步研究

目的:在原核表达系统中表达对凋亡神经元具有保护作用的重要蛋白Bcl-XL与蛋白质转导序列(PTD)的融合蛋白,并检测重组蛋白对重金属离子所诱导的细胞凋亡的保护作用。方法:通过RT-PCR的方法,用Bcl-XL特异引物从乳腺癌细胞系MCF-7细胞的总RNA中扩增出Bcl-XL基因,构建相应的原核表达载体,体外表达的TAT-Bcl-XL融合蛋白经镍亲和层析介质纯化后,通过免疫荧光方法检测其转导293T细胞的能力;并用流式细胞仪检测融合蛋白抑制细胞凋亡的能力。结果:经RT-PCR从MCF-7细胞总RNA中得到相应的TAT-Bcl-XL基因片段,并将其克隆入pCRT7/CT-TOPO载体中,重组质粒pTBTOPO转化大肠杆菌后,在SDS-PAGE和Western blot的结果中出现了与预期分子量相同的蛋白条带和阳性信号,纯化的TAT-Bcl-XL重组蛋白经免疫荧光检测,主要分布于细胞的细胞质中。流式细胞仪的检测结果显示融合表达蛋白可以有效地抑制Zn2+离子所诱导的细胞凋亡,使细胞的存活率提高40%。结论:TAT-Bcl-XL融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,初步的功能性检测表明融合蛋白具有抑制细胞凋亡的功能。