带有蛋白转导结构域的Bcr/Abl癌蛋白片段的表达及其跨膜转运

HIV 1编码的反式激活蛋白TAT具有将细胞外蛋白转导进入细胞的基序 ,称为蛋白转导结构域 (PTD) .为研究PTD介导的PTD Bcr Abl融合蛋白的跨膜转运 ,合成了编码PTD的基因片段 ,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋白bcr abl基因片段融合 .在大肠杆菌中表达纯化了融合蛋白 ,将纯化的融合蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后 ,发现PTD基序可以介导Bcr Abl蛋白自由从细胞外跨膜转导进入细胞内 .研究结果可能为用外源蛋白负载 (loading)免疫活性细胞如抗原提呈细胞提供新的途径 .

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。

分泌型TAT蛋白转导结构域基因通用真核表达载体的构建及表达

目的:构建一个全新的分泌型TAT蛋白转导结构域基因哺乳动物细胞融合表达载体并对融合蛋白的表达进行分析。方法:依照编码TATPTD11肽及所引入的BamHI酶识别序列和增强性绿色荧光蛋白N端7个氨基酸的碱基序列合成了3条引物,以egfp基因为模板通过依次3轮PCR扩增得到tategfp融合基因,该基因片段以SfiI和HindⅢ双酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pSectagA,构建成重组载体pSecTATmegfp,BamHI单酶切后该载体自连,即得到可通用的真核表达载体pSecTATm,重组质粒pSecTATmegfp转染HEK293细胞,融合蛋白的表达用Westernblot分析。结果:酶切及测序证实表达载体pSecTATm构建成功,Westernblot表明TATEGFP融合蛋白在HEK293细胞中获得表达并分泌到细胞培养液中。结论:成功地构建了分泌型TAT蛋白转导结构域基因的哺乳动物细胞融合表达载体,为更充分发挥TAT蛋白转导结构域在蛋白质功能及疾病治疗研究中的应用打下了基础。

蛋白转导结构域4-铜/锌-超氧化物歧化酶融合蛋白的制备及其穿细胞膜的功能研究

目的拟构建蛋白转导结构域(PTD)4-铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)原核表达质粒,纯化制备PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,探讨其穿膜能力。方法设计合成hCu/ZnSOD引物,扩增hCu/ZnSOD cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒PET16b-PTD4进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;获得PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD(CDs)原核表达载体,导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni_2^+亲和层析、收集目的蛋白。融合蛋白孵育人心肌细胞,免疫荧光法检测融合蛋白穿膜能力。结果通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致。设计并简并PTD4-Cu/ZnSOD基因长度为567 bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GENBANK中Cu/ZnSOD序列相一致,并构建了相应的原核表达质粒。并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD4-Cu/ZnSOD具有良好水溶性。SDS-page分析显示构建的PTD4-Cu/ZnSOD分子量约为20 kDa,与预期的蛋白分子量20.45 kDa相符合。融合蛋白可以穿透心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论成功地构建了PET16bPTD4-Cu/ZnSOD原核表达质粒,获得了可穿透心肌细胞膜的PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,为应用Cu/ZnSOD治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。

TAT蛋白转导结构域的研究进展

目前，应用基因重组技术人工合成治疗性蛋白质分子已经成为可能。但如何有效地将合成的蛋白质转运进入目标组织和细胞仍是当前需要解决的重大难题。蛋白转导结构域HIV-TAT的发现为体内外转运蛋白质进入细胞提供了新思路。近年来蛋白转导结构域转运蛋白质进入细胞的有效性以及其在疾病治疗中的价值已经得到不断证实。现主要对蛋白转导结构域HIV-TAT的研究进展作一综述。

蛋白转导结构域介导BCR/ABL对慢性粒细胞白血病患者T细胞的活化作用

目的 研究蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL融合蛋白对慢性粒细胞白血病(CML)患者T细胞的特异性活化作用。方法 利用基因工程技术将PTD基因与CMLb3a2bcr abl基因融合并原核表达 ,纯化的PTD BCR ABL融合蛋白与CML患者外周血单个核细胞 (PBMNC)体外共孵育 ,用流式细胞仪分别检测CD4+ 、CD8+ T细胞的早期活化抗原CD6 9的表达。结果 PTD BCR ABL抗原体外激活CD8+ T细胞的最佳浓度为 10 0 μg ml,时间为 3d。在此刺激条件下 ,15例CML患者中 ,10例表现CD8+ T细胞早期活化 ,CD6 9表达率为 (15 .0 1± 3.75 ) % ;4例表现CD4+ T细胞早期活化 ,CD6 9表达率为 (10 .32± 3.0 8) % ;其中有 3例CD8+ 和CD4+ T细胞同时活化 ;而对照的BCR ABL抗原刺激组无一例表现CD8+ 或CD4 + T细胞活化 ,其CD6 9表达率分别为 (1.36± 0 .31) %和 (1.4 1± 0 .4 3) % ,与PBS空白对照组相比差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 PTD能将外源性BCR ABL抗原转导入抗原呈递细胞内 ,加工呈递后激活抗原特异性CD8+ 及CD4+ T细胞。

蛋白转导结构域在抗原交叉提呈中的应用进展

大量实验证明,蛋白转导结构域可高效携带多种类型的物质穿越细胞膜进入细胞质。因此,将蛋白转导结构域与外源抗原连接(融合)可以促进外源抗原的交叉提呈,递送外源抗原进入MHC-Ⅰ型途径进行加工提呈,从而诱导CTL应答。本文综述了蛋白转导结构域在抗原交叉提呈中的应用进展。

蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ的研制

目的:制备蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ(PTD-mIFN-γ),为研究PTD-mIFN-γ功能作准备。方法:以质粒pUC19/mIFN-γ为模板,经3轮聚合酶链反应(PCR)扩增编码PTD-mIFN-γ片段,克隆于质粒pUC19上,测序鉴定正确后构建到pQE80L表达质粒载体中,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot法检测表达的目的蛋白,镍离子-次氨基三乙酸(Ni2+-NTA)凝胶亲和层析纯化重组蛋白,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测PTD-mIFN-γ。结果:PCR扩增得到编码PTD-mIFN-γ的cDNA,SDS-PAGE和Western blot法分析显示重组蛋白获得了高效表达,ELISA法检测出目的蛋白。结论:成功制备了PTD-mIFN-γ。

重组蛋白转导结构域-SARA融合蛋白生物学功能的初步研究

目的初步研究重组蛋白转导结构域(Protein transduction domain,PTD)-SARA融合蛋白(PTD-SARA)抗肾脏纤维化的生物学功能。方法采用免疫细胞化学法检测重组PTD-SARA融合蛋白的穿膜作用;通过显微镜观察人肾小管上皮细胞HK2形态学变化,Western blot法测定上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和磷酸化Smad3蛋白水平,以比较PTD-SARA融合蛋白和SARA蛋白抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱发的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化作用。结果重组PTD-SARA融合蛋白可高效地转入细胞胞质与胞核;PTD-SARA融合蛋白与SARA蛋白相比,能更显著地上调E-cadherin蛋白的表达,下调α-SMA和磷酸化Smad3蛋白的表达,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论与SARA蛋白相比,PTD-SARA融合蛋白可以高效地进入细胞胞质及胞核,并能明显地抑制TGF-β1诱发的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化作用,为进一步研究重组PTD-SARA融合蛋白防治肾脏纤维化奠定了基础。

一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。

蛋白质转导结构域的跨血脑屏障药物递送

药物递送入脑的主要障碍是血脑屏障,为克服血脑屏障,目前主要采取神经外科手术、增加分子脂溶性、通过内源性血脑屏障转运载体的递送策略。PTD介导跨血脑屏障药物递送是近来出现的新技术,可以方便、高效地使各种分子通过外周血、腹腔等途径,跨越血脑屏障进入脊髓、脑组织细胞。PTD递送快捷、简单、安全,为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的研究思路。

新型融合蛋白——蛋白转导结构域4‑超氧化物歧化酶1减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤的实验研究

目的研究新型融合蛋白——蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)4超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1对心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)大鼠肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的影响,探讨PTD4SOD1对再灌注心肌的保护作用。方法40只SPF级雄性SD大鼠,体重(330±20)g,按随机数字表法分为4组:假手术组(S组)、MI/RI组、SOD1蛋白组(SOD1组)、PTD4SOD1融合蛋白组(PTD4SOD1组),每组10只。S组只穿线不结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending,LAD),其余3组均通过结扎与松解LAD的方法制备大鼠MI/RI模型,缺血30 min,再灌注120 min。S组、MI/RI组在再灌注的同时通过尾静脉分别注射0.9%氯化钠注射液(1 ml),SOD1组在再灌注的同时通过尾静脉注射SOD1蛋白500μg(1 ml),PTD4SOD1组在再灌注的同时通过尾静脉注射PTD4SOD1500μg(1 ml)。再灌注结束时通过左心室采血5 ml,后快速摘取心脏。分别使用免疫荧光检测PTD4SOD1在大鼠MI/RI模型中的穿膜能力,比色法检测CK、LDH的含量,硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)染色法检测MDA的含量。结果免疫荧光结果显示,S组、MI/RI组、SOD1组均没有代表融合蛋白的荧光出现,PTD4SOD1组出现荧光。与S组比较,其余3组CK、LDH和MDA含量均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);MI/RI组CK、LDH、MDA含量与SOD1组差异无统计学意义(P>0.05),PTD4SOD1组CK、LDH、MDA含量较MI/RI组和SOD1组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PTD4与SOD1重组后表达纯化的PTD4SOD1能显著降低血清CK、LDH和MDA值,抑制脂质过氧化反应,实现了对心肌细胞的保护作用。

TAT蛋白质转导结构域与SV40启动子特异的三锌指结构融合蛋白的表达与纯化

利用蛋白质转导结构域(PTDs)可以将与之融合表达的蛋白质直接送入细胞中。将通过筛选噬菌体展示锌指文库得到的特异作用于SV40启动子上9bp序列的三锌指结构的序列插入含有TAT蛋白的蛋白质转导结构域的表达载体pET-TAT-NLS中,构建融合蛋白的表达载体pET-TAT-NLS-clone3。融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到了可溶性表达,含量约占总蛋白的18%;并通过镍亲和凝胶层析柱得到了较好的纯化融合蛋白。

利用蛋白质转导结构域进行生物大分子的胞内转运

由于细胞膜的存在限制了生物利用度,大分子物质的胞内转运还存在许多问题。最近通过对蛋白质转导结构域的研究已经排除了这一障碍。应用蛋白质转导结构域将大分子蛋白质、核酸、病毒、小分子物质转运到目标细胞内已引起了人们越来越多的关注。虽然十年前就发现了蛋白质转导结构域,如触足蛋白、Tat及Vp22,但其作用机制刚刚明确并开始被广泛的应用。除了富含精氨酸的蛋白质转导结构域,我们通过流式细胞光密度的测定和酶的测定,还发现赖氨酸同聚物也能够介导许多细胞的转导过程。蛋白质转导结构域,有天然存在的和人工合成的,已越来越广泛的应用于将生物活性物质转运到细胞内以便更好的治疗某些疾病,如癌症、中风、关节炎等等。

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.

一种新兴的富有生命力的生物技术--蛋白转导

综述了蛋白转导的发现、蛋白转导结构域(PTD)的结构组成特点、蛋白转导的作用特点、PTD的作用机理以及蛋白转导的应用前景等。指出蛋白转导是生命科学领域一种新兴的生物技术,其高效的跨膜转运功能和细胞间自主传递的特点彻底打破了常规的基因转移模式,为基因治疗和高效药物与新型疫苗研究开辟了新的途径。

蛋白转导及其在缺血性卒中的应用

由于血脑屏障的存在 ,中枢神经系统的药物治疗存在一定的困难。人们采用颅内微注射、转运载体法来避开血脑屏障 ,但上述方法为有创性 ,且操作复杂。近年来 ,人们发现蛋白转导结构域具有穿透细胞膜的能力 ,并能携带大分子肽类通透细胞膜进入细胞内发挥生物活性。文章对蛋白转导、转导机制及在缺血性卒中的应用进行了综述。

TAT-Smad7-HA融合蛋白的表达及其转导活性验证

目的构建、表达、纯化、鉴定并标记TAT-Smad7-HA融合蛋白,验证其在体外培养的人原代瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast cell,KFB)中的转导活性。方法分别将TAT-PTD、Smad7基因和HA片段依次连接入pET32a(+)质粒构建成pTAT-Smad7-HA重组原核表达载体,IPTG诱导表达后经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的片段回收和FITC标记后,将FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白作用于体外培养的人原代KFB以观察其转导活性。结果成功构建了TAT-Smad7-HA融合蛋白的原核表达载体pTAT-Smad7-HA,目的蛋白在诱导后获得了高效表达(占菌体总蛋白的25%以上),并成功进行了纯化(纯度达95%以上)、脱盐柱脱盐、Western blot验证、硫氧环蛋白切除及FITC标记,得到相对分子质量约为50×103的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并进一步在体外培养的人KFB细胞中证实了其高转导活性。结论本实验获得了高纯度的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并验证了其在KFB中的高转导活性。

蛋白质转导——外源物质进入细胞的新工具

相对于常规的基因转移技术 ,蛋白质直接跨过细胞膜进入细胞 (proteintransduction ,蛋白质转导 )还比较新颖。蛋白质转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)最早发现于HIV的TAT蛋白 ,之后证明多种天然的和人工合成的蛋白质和多肽都具有蛋白质转导能力。PTD有相似的结构特征 ,但是其转导的详细机制仍不清楚 ,很多研究结果倾向于静电相互作用模式。大量研究证明 ,PTD具有转导能力强、无细胞特异性、能够穿过血脑屏障等特点 ,这为癌症、AIDS。

细胞穿透肽YARA介导增强型绿色荧光蛋白转导入人结直肠癌细胞的实验研究

目的构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,表达并纯化出融合蛋白YARA-EGFP,观察其穿透人结直肠癌细胞的情况。方法用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,将鉴定和纯化后的融合蛋白加入体外培养的人结直肠癌细胞。结果得到纯化的融合蛋白YARA-EGFP,能高效地转导入体外培养的人结直肠癌细胞,并表现出剂量和时间依赖性,MTT法检测在其高浓度时仍对细胞无毒性。结论 YARA-EGFP融合蛋白能高效地转导入体外培养的人结直肠癌细胞。