活性维生素D3对大鼠肺纤维化中蛋白激酶D1介导的抗氧化通路的影响

目的：探讨肺纤维化发生发展中蛋白激酶D1（PKD1）介导的线粒体抗氧化通路的作用以及活性维生素D3在纤维化过程中对该通路的影响。方法：雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和治疗组。应用实时荧光定量PCR和免疫组织化学分别从mRNA和蛋白质水平检测大鼠肺组织中PKD1、核转录因子（NF-κB）和锰超氧化物歧化酶（MnSOD）的表达。结果：在第14天，治疗组和模型组中PKD1、NF-κB和MnSOD的表达量都显著低于对照组，而治疗组中3种因子的表达量又明显高于模型组；在第21天，3种因子在模型组和治疗组中的表达量明显高于对照组。在第28天，3种因子在模型组和治疗组中的表达量与对照组相比两两之间均没有差异。结论：PKD1-MnSOD线粒体抗氧化通路在博莱霉素引起的大鼠肺纤维化早期发挥重要作用，活性维生素D3能够上调这一抗氧化通路，具有一定的抗氧化作用，对大鼠肺纤维化的发生发展具有一定的抑制作用。

STAT5与CyclinB1、CyclinD1、C-fos、C-myc在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:探讨信号转导和转录激活因子-5(signal transducer and activator of transcripton5,STAT5)、细胞周期素B1(cy-clinB1)、细胞周期素D1(cyclinD1)蛋白、原癌基因c-fos和c-myc蛋白在非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及意义。方法:用免疫组化SP、SABC法检测38例手术切除的非小细胞肺癌组织和20例正常肺组织中STAT5、cyclinB1、cyclinD1、c-fos和c-myc的蛋白表达。结果:STAT5、cyclinB1、cyclinD1、c-fos和c-myc在非小细胞肺癌中的表达明显高于正常肺组织,差异有统计学意义(P<0.01);STAT5在非小细胞肺癌中的表达,与患者的年龄、肿瘤大小、组织分化程度、淋巴结转移及TNM分期等病理因素无关(P>0.05),同样,在非小细胞肺癌中cyclinB1、cyclinD1、c-fos和c-myc的表达与上述临床病理因素也无关;STAT5和cyclinB1、cyclinD1在NSCLC组织中的表达均呈显著正相关(P<0.05);STAT5与c-fos、c-myc的表达均呈无相关(P>0.05)。结论:研究结果显示在非小细胞肺癌中存在STAT5、cyclinB1、cyclinD1、c-fos和c-myc的过度表达,但是与临床病理因素无关,提示它们参与了非小细胞肺癌的发生,但与肿瘤的进展可能无关。CyclinB1和cyclinD1的表达可能由STAT5调控;在NSCLC的发生中,STAT5可能通过上调cyclinB1和cyclinD1的表达,促进细胞周期进展和细胞的恶性转化,促进肿瘤的形成,而c-fos和c-myc可能不是通过STAT5信号途径来诱导肿瘤的发生。

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P、L和M2-1重组质粒的构建和鉴定

目的构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况。方法采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT。设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P。同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L。用重组质粒转染BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达。结果成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达。结论获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础。

蒲公英多糖通过下调LncRNA CCAT1表达抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭

目的通过观察蒲公英多糖(dandelion polysaccharide,DP)联合小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向沉默长链非编码RNA(LncRNA)结肠癌相关转录因子1(colon cancer-associated transcript 1,CCAT1)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,探究DP抗乳腺癌可能的分子机制。方法在线数据工具分析CCAT1在乳腺癌组织中的差异表达,qRT-PCR分别检测CCAT1在乳腺癌细胞系中的差异表达、DP(100、200μg/mL)对MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231细胞中CCAT1表达的影响以及siCCAT1对MDA-MB-231细胞中CCAT1表达的影响;CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验分别检测DP联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞活力、迁移和侵袭能力的影响;在线数据工具预测CCAT1下游靶基因及靶基因富集的信号通路;Western blotting检测DP联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)/周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinases 6,CDK6)信号通路中关键蛋白表达的影响。结果与癌旁正常组织及正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,CCAT1在人乳腺癌组织和细胞中高表达(P<0.01);与对照组比较,DP呈剂量和时间相关性地抑制MDA-MB-231及MCF-7细胞活力(P<0.05、0.01),但对MCF-10A细胞活力无明显影响;与MCF-10A及MCF-7细胞相比,DP可显著下调MDA-MB-231细胞中CCAT1表达水平(P<0.01);与siNC组比较,siRNA可显著降低CCAT1在MDA-MB-231细胞中的表达(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1更加显著降低了MDA-MB-231细胞中CCAT1的表达水平(P<0.01);与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能抑制MDA-MB-231细胞活力(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用更为明显(P<0.01);与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的作用更为明显(P<0.01);与单独用DP或siCCAT1相比,DP联合siCCAT1处理MDA-MB-231细胞中EMT进程相关蛋白E-cadherin表达上调更为显著(P<0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达下调更为显著(P<0.01);在线生物工具预测出CCAT1靶基因共1929个,这些靶基因主要富集在RNA聚合酶II启动子转录调控、信号转导、转录调控等关键生物过程;富集的通路主要有癌症、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路;与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能下调MDA-MB-231细胞中Akt/GSK-3β/Cyclin D1/CDK6信号通路关键蛋白p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、Cyclin D1、CDK6蛋白表达水平(P<0.05、0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1应用时对其关键蛋白下调作用更为显著(P<0.01)。结论DP联合siCCAT1显著抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和EMT进程,其机制可能与下调MDA-MB-231细胞中CCAT1表达进而抑制Akt/GSK-3β/Cyclin D1/CDK6信号通路有关。

核转录因子κB在膀胱癌中的表达及临床意义

背景与目的:实体癌(如乳腺癌、肝癌、胰腺癌)中的研究提示核转录因子κB的异常表达对血管生长、细胞周期相关基因进行调控。本研究探讨膀胱癌及非癌膀胱粘膜中核转录因子κB及其调控基因的表达差异及其临床意义。方法:30例膀胱癌和13例非癌膀胱粘膜共43例冰冻切片行免疫组织化学检测p50、p52、p65、c-Rel、RelB、IκBɑ的蛋白表达水平,免疫印迹检测5例配对样本的p65(NF-κB家族一个重要亚基)的蛋白表达。13例配对标本RT-PCR检测p50、p52、p65、c-Rel、RelB、IκBɑ、周期蛋白D1、白介素-8的mRNA水平。结果:在膀胱癌组织及非癌膀胱粘膜中均见到p50、p52、p65、c-Rel、RelB、IκBɑ、周期蛋白D1、白介素-8的mRNA表达,但前者较后者明显为强(分别为P<0.01;P<0.05;P<0.01;P<0.01;P<0.05;P<0.05;P<0.05;P<0.05)。膀胱癌中p50、p52、p65、c-Rel、RelB核着色也明显增强(分别为P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01)。同时,免疫印迹证明在膀胱癌中p65,核转录因子κB一个重要亚基的表达增加。膀胱癌中淋巴结转移组与无淋巴结转移组相比,p52,p65、c-Rel等蛋白表达等级计分有显著差异(分别为P<0.01;P<0.01;P<0.05)。结论:膀胱癌中NF-κB家族及其调控基因表达较正常膀胱粘膜明显更强,并可能与膀胱癌淋巴转移相关。

HIP1在维生素K3诱导Hela细胞损伤中的表达及意义

目的:观察Huntingtin相关蛋白1(HIP1)在维生素K3诱导Hela细胞损伤中的表达及意义。方法:对数生长期Hela细胞随机分为对照组(Control)、VK3处理组(VK3)、VK3与NAC联合作用组(VK3+NAC)及NAC单独应用组(NAC);MTT法检测各组细胞存活率;Western blotting法检测各组HIP1、NFκ-B蛋白表达水平;RT-PCR方法检测各组Cyclin D1 mRNA表达水平。结果:与对照组相比,VK3组Hela细胞存活率降低(P<0.01),HIP1蛋白、NF-κB蛋白表达量降低(P<0.05),Cyclin D1 mRNA表达量明显下降(P<0.05);与VK3组相比,VK3与NAC联合应用组细胞存活率增加,能够明显拮抗HIP1蛋白,NFκ-B蛋白表达量和Cyclin D1 mRNA表达量均增加(P<0.05)。结论:VK3具有抑制细胞增殖作用,可能与降低HIP1的蛋白表达水平有关。

大鼠舌癌变过程中NF-κB和cyclinD1蛋白的表达

目的：探讨大鼠口腔癌变过程中核转录因子κBp65（NF-d3p65）、cyclinDl蛋白的表达及其生物学意义。方法：0．002％4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）饮水喂养Wistar大鼠9～32周建立大鼠舌癌变模型，用免疫组化sP法检测38例大鼠舌癌变过程不同病理阶段组织中NF-d3P65、cyclinD1蛋白的表达。结果：常黏膜、轻度异常增生、中度异常增生、重度异常增生、原位癌、鳞癌组织中，NF-d3的阳性率分别是20％、20％、50％、62．5％、50％和83．33％，（鳞癌与正常黏膜组织中NF-d3P65的表达有显著性差异（P〈0．05）；cyclin D1阳性率分别是20％、60％、62．5％、87．5％、100％和83．33％，重度异常增生、原位癌、鳞癌组织中cyclin D1表达显著高于正常黏膜（P〈0．05或P〈0.01）。两者的表达均与组织的病理学分级相关（P〈0．01），两者的表达在鳞癌阶段具有相关性（P〈0．05）。结论iNF-κBp65、cydinDl蛋白表达与口腔癌发生发展相关，NF-d3通路在口腔黏膜癌变过程起重要作用，NF-κB、cyclinD1可能成为口腔癌变病变生物标志物之一。

重症肺炎患者外泌体HMGB1/RAGE/NF-κB基因表达及其与病情进展的关系

目的 探究重症肺炎患者外泌体高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/晚期糖基化终产物受体(RAGE)/核转录因子-κB(NF-κB)基因表达及其与病情进展的关系。方法 选择2018年6月-2021年6月焦作市人民医院收治的重症肺炎患者96例为重症组,并按性别和年龄匹配同期收治的96例普通肺部感染患者为对照组,比较两组患者外泌体上HMGB1/RAGE/NF-κB基因表达,根据CURB-65评分(高危组vs.低危组)、初始治疗疗效(有效组vs.失败组)及28 d内预后情况(死亡组vs.存活组)将重症组患者分为不同亚组,比较外泌体上HMGB1/RAGE/NF-κB基因表达,并分析HMGB1、RAGE、NF-κB表达单独及联合对重症肺炎患者临床结局的预测效能。结果 重症组患者外泌体上HMGB1、RAGE、NF-κB p65表达水平高于对照组(P<0.05);高危组患者外泌体上HMGB1、RAGE、NF-κB p65表达水平高于低危组(P<0.05);失败组患者入院时及入院后7 d外泌体上HMGB1、RAGE、NF-κB p65表达水平高于有效组(P<0.05);死亡组入院后7 d外泌体上HMGB1、RAGE、NF-κB p65表达水平高于存活组(P<0.05);HMGB1、RAGE、NF-κB p65水平单独及联合预测重症肺炎患者28 d内死亡的曲线下面积(AUC)为0.823、0.739、0.753和0.917,且联合预测的AUC高于单独预测(P<0.05)。结论 重症肺炎患者外泌体上HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路活化与死亡风险、治疗效果及预后不良有关。

中国六个白灵菇(Pleurotus nebrodensis)商业菌株的DNA指纹图谱分析

在中国的6个白灵菇商业菌株中,ITS区域的621bpDNA片段和蛋白转录延长因子的519bpDNA片段的序列完全相同,表明该6个菌株属同一个种。RAPD分析结果表明,其中5个白灵菇菌株的亲缘关系较近,用PAUP4.0软件中的UPGMA方法进行聚类分析,遗传差异小于3.4%,但这5个菌株与6号菌株的差异较大,达到了16.9%。在此基础上构建了6号菌株的特异性标记引物。

活性维生素D_3抗炎机制对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

目的探讨活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。方法雄性SD大鼠24只,随机分为正常对照组(NC),糖尿病模型组(DM),活性维生素D3治疗组(DC),每组8只。12周后,观测肾组织形态学和肾功能变化,尿白蛋白排泄率等指标的变化,用免疫组化法检测肾脏转化生长因子-β1(TGF-β1),核转录因子-κB(NF-κB)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、CD68表达水平的变化,RT-PCR方法检测肾组织TGF-β1,NF-κB,MCP-1mRNA表达水平的变化。结果与NC组比较,第12周末DM组大鼠的肾脏肥大指数(KW/BW)、平均肾小球体积(MGV)、系膜面积比(FMA)、尿白蛋白排泄率(UAER)、血肌酐(Scr)均明显升高(P<0.01),肾组织TGF-β1,NF-κB,MCP-1,CD68蛋白表达水平也显著增高(P<0.01),同时肾组织TGF-β1,NF-κB,MCP-1mRNA表达水平均升高(P<0.01)。DC组的上述指标与DM组比较,则有明显的降低(P<0.05)。结论活性维生素D3可通过抑制糖尿病大鼠肾脏TGF-β1,NF-κB,MCP-1等细胞因子的表达,抑制巨噬细胞浸润,从而经由抗炎机制发挥对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。

他克莫司对5-氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡的影响及其机制的初步探讨

目的:观察他克莫司(FK506)对5氟尿嘧啶(5FU)诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的影响,并对其机制进行初步探讨。方法:体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721;应用流式细胞仪检测5FU及联合FK506对细胞凋亡和细胞周期的影响;TransAMNF-κB核转录因子活性检测试剂盒检测NFκBp65活性;细胞免疫组织化学检测NFκBp65激活后入核情况;免疫印迹分析CyclinD1蛋白表达差异。结果:5-FU可诱导肝癌细胞凋亡,其作用随浓度的增加而增强(P<0.05);随着5-FU用药浓度的增加,S期细胞比例和细胞增殖指数(PI)也增加;5-FU可激活NFκB而入核,CyclinD1蛋白的表达逐渐增强。FK506预处理增强了5-FU诱导SMMC7721细胞凋亡的作用,同时S期细胞比例和PI也减少;FK506预处理可抑制NF-κB入核,并可下调CyclinD1基因的表达。结论:FK506能够协同5FU诱导肝癌细胞株凋亡,增强肝癌细胞株对5-FU的敏感性,这种作用可能是通过抑制NFκB活性进而下调CyclinD1基因的表达,导致G0/G1期停滞而实现。

有氧锻炼通过TFEB-自噬溶酶体途径减轻慢性脑缺血大鼠认知功能障碍的研究

目的观察有氧锻炼对慢性脑缺血大鼠TFEB-自噬溶酶体途径及认知功能障碍的影响。方法SD大鼠随机分为3组:对照组、慢性脑缺血组和慢性脑缺血+有氧锻炼组。用双侧颈总动脉结扎的方法建立慢性脑缺血模型。有氧锻炼组进行跑步锻炼12w。用Morris水迷宫比较各组大鼠的空间学习能力。用苏木精-伊红染色比较各组大鼠海马神经元损伤的状况。用Western-blotting比较各组大鼠海马组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、LAMP-1、CTSD以及核内TFEB的含量。结果与对照组相比,慢性脑缺血组大鼠平均逃避潜伏期显著延长,隐匿平台象限停留时间显著缩短,通过隐匿平台次数显著降低;形态异常的海马神经元显著增加,Western-blotting显示,LC3/LC3、LAMP-1、CTSD以及核内TFEB显著降低,p62显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与慢性脑缺血组相比,有氧锻炼组大鼠平均逃避潜伏期显著缩短,隐匿平台象限停留时间显著延长,通过隐匿平台次数显著增加;形态异常的海马神经元显著减少,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-1、CTSD以及核内TFEB显著升高,p62显著降低;差异有统计学意义(P<0.05)。结论有氧锻炼通过激活TFEB-自噬溶酶体途径减轻慢性脑缺血所致的大鼠认知功能障碍。

当归补血汤对博莱霉素致肺纤维化大鼠PKD1/NF-κB/MnSOD信号通路的影响

目的:观察当归补血汤对博莱霉素致肺纤维化模型大鼠肺组织病理及蛋白激酶D1(PKD1)/核转录因子-κB(NF-κB)/锰超氧化物歧化酶(MnSOD)介导的氧化应激通路的影响,探讨该方干预肺纤维化作用机制。方法:32只雄性SPF级SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、当归补血汤组、泼尼松组,每组8只。除假手术组外,其余各组气管内滴注博莱霉素制备肺纤维化大鼠模型。造模24 h后,当归补血汤组给予当归补血汤水溶液(0.81 g·kg^-1)灌胃,泼尼松组给予泼尼松水溶液(0.005 g·kg^-1)灌胃,假手术组、模型组予等体积生理盐水灌胃。于用药14 d后,股动脉采血并分离血清,剖胸取肺。苏木素-伊红(HE)染色和马松(Masson)染色观察大鼠肺组织病理改变,并行Szapiel评分和Ashcroft评分;测定血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测PKD1,NF-κB,MnSOD mRNA及蛋白的表达。结果:与假手术组比较,模型组Szapiel评分和Ashcroft评分明显升高(P<0.05),血清MDA含量显著升高,SOD,CAT,GSH-Px活性显著降低,肺组织PKD1,NF-κB,MnSOD mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,当归补血汤组明显下降Szapiel评分和Ashcroft评分(P<0.05),显著降低血清MDA含量,明显升高SOD,CAT,GSH-Px活性,明显降低肺组织PKD1,NF-κB,MnSOD mRNA及蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:当归补血汤可通过调节PKD1/NF-κB/MnSOD线粒体核抗氧化通路,提高机体抗氧化能力,从而减轻肺纤维化程度。

结肠癌中ID1上调OCT4信号通路的机制研究

DNA结合抑制蛋白-1(inhibitor of DNA binding 1,ID1)在结肠癌、肺癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中异常高表达,并与肿瘤恶性进展及患者不良预后密切相关。已有研究发现,ID1在结肠癌中可以维持肿瘤细胞干细胞样特性,介导肿瘤干细胞耐药,但其分子生物学机制并未被完全阐明。通过免疫印迹、基因集富集分析、双荧光素酶报告基因检测及实时定量PCR,本研究发现ID1可从转录水平上调维持肿瘤细胞干性的关键转录因子八聚体结合蛋白(octamer binding transcription factor,OCT4)的蛋白表达及信号通路活性。利用体外成球实验,本研究证明过表达OCT4可逆转敲低ID1对干细胞成球能力的抑制作用。在进一步的机制研究中,利用JASPAR及GEPIA数据库,本研究预测并得到能够负向调控OCT4转录的转录抑制因子叉头蛋白D3(forkhead box D3,FOXD3)。通过免疫共沉淀、免疫荧光共聚焦及实时定量PCR等方法,本研究最终证明ID1通过与转录抑制因子FOXD3相互作用,抑制其活性从而上调OCT4的转录及信号通路活性。综上,本研究为结肠癌干细胞的分子调控机制提供了新的理论基础,研究中发现的ID1-FOXD3蛋白-蛋白相互作用为结肠癌治疗提供了新的潜在干预靶点。