蛋白酶体亚基LMP-2、Survivin、Caspase-3在稽留流产绒毛及蜕膜组织中的表达

目的:检测稽留流产绒毛及蜕膜组织中蛋白酶体亚基低分子质量多肽-2(proteasome subunit low molecu-lar weight polypeptide 2,LMP-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate specific protease 3,Caspase-3)、生存素(Survivin)的表达,旨在探讨稽留流产的发病机制。方法:采用免疫组织化学染色方法检测30例稽留流产(实验组)患者绒毛及蜕膜组织中LMP-2、Caspase-3、Survivin的表达,并以30例正常早孕人工流产绒毛及蜕膜组织为对照组。结果:稽留流产组绒毛及蜕膜中LMP-2、Survivin的表达均低于正常早孕组,Caspase-3的表达则高于正常早孕组,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组的绒毛及蜕膜Caspase-3与LMP-2及Survivin的表达均呈负相关,LMP-2与Survivin的表达呈正相关(P<0.05)。结论:LMP-2、Survivin及Caspase-3的异常表达在稽留流产的发生中起重要作用。

蛋白酶体亚基LMP 2在稽留流产的蜕膜和绒毛组织中的表达

目的探讨蛋白酶体亚基LMP-2在稽留流产中的作用。方法 用免疫组化方法研究LMP-2在201例稽留流产中的48例绒毛和45例脱膜与114例正常早孕人工流产中的56例绒毛和58例蜕膜中的表达。结果LMP-2在稽留流产的绒毛和蜕膜中的表达均低于正常早孕人工流产的绒毛和蜕膜,二者间的表达强度差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LMP-2在稽留流产中绒毛与蜕膜的表达减弱提示泛素-蛋白酶体通路介导的细胞蛋白降解参与调控滋养层细胞的生长过程。

慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌组织20s蛋白酶体C_2亚基的基因及蛋白表达的研究

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌组织内蛋白降解的信号分子——泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达水平及意义。方法采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹(Westernblot)法测定大鼠伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达。结果 RT-PCR结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达(IOD值)较对照组增加,差异有统计学意义(P<0.01);Westernblot结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达较对照组增强,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 COPD大鼠骨骼肌泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达均显著增强,提示骨骼肌内泛素-蛋白酶体途径活性上调,是蛋白降解增强的原因之一。

肿瘤坏死因子α对COPD大鼠骨骼肌蛋白酶体C2亚基表达的影响

目的研究COPD大鼠骨骼肌蛋白酶体C2亚基的表达,以及TNF-α对其表达的影响,探讨COPD大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢的机制。方法SD大鼠随机分为对照组、COPD组及COPD+TNF-α组,每组15只。COPD组和COPD+TNF-α组大鼠用单纯熏香烟法制成COPD大鼠动物模型,分离其伸趾长肌,分别给予不含和含TNF-α(10μg/L)的孵育液进行离体有氧孵育。利用实时定量PCR和Western blot技术检测C2亚基在转录和蛋白水平的变化。结果COPD组和COPD+TNF-α组C2亚基mRNA表达为对照组的1.74倍和1.95倍(P均<0.01),其中COPD+TNF-α组显著高于COPD组(P<0.01)。COPD组和COPD+TNF-α组C2亚基蛋白表达也显著高于对照组(1.04±0.15和1.23±0.16比0.71±0.12,P<0.05和P<0.01),COPD组和COPD+TNF-α组表达无显著差异(P>0.05)。结论COPD时骨骼肌蛋白降解增加可能是经由TNF-α激活泛素-蛋白酶体途径所致。

免疫蛋白酶体β2i亚基在DOCA/盐敏感小鼠血管炎症反应中的作用

目的:探讨免疫蛋白酶体β2i亚基在醋酸脱氧皮质酮(DOCA)/盐敏感小鼠血管炎症反应中的作用。方法:将β2i基因敲除小鼠和同窝对照野生雄性小鼠的右侧肾脏切除并在皮下植入DOCA药片,然后饮用Na Cl溶液(1%)3周,建立盐敏感高血压小鼠模型。3周后分别提取各实验组新鲜胸主动脉组织中总的RNA和蛋白,或用福尔马林固定和石蜡包埋组织后进行切片。采用Western blot、实时荧光定量PCR和免疫组化法分别检测胸主动脉中β2i、巨噬细胞标志物Mac-2、NF-κB及促炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达水平。结果:与假手术组相比,DOCA/盐处理明显增高血管组织中β2i的mRNA和蛋白表达水平、巨噬细胞浸润数、NF-κB及促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平;相反,敲除β2i基因明显抑制了DOCA/盐诱导的这些改变。结论:免疫蛋白酶体β2i亚基可能通过激活NF-κB信号通路促进DOCA/盐诱导的血管炎症反应。

泛素-蛋白酶体系统在非小细胞肺癌表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂继发性耐药中的作用

目的探讨泛素-蛋白酶体系统(UPS)在非小细胞肺癌表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)继发性耐药中的作用及机制。方法选取经病理证实肺腺癌患者98例,其中49例患者存在EGFR基因敏感突变且EGFR-TKI治疗敏感,采集其组织标本作为EGFR-TKI敏感组(n=49),另49例患者行EGFR-TKI治疗出现获得性耐药,采集其组织标本作为EGFR-TKI耐药组(n=49)。应用连续荧光监测法检测两组组织标本中UPS标志物CT-L的活性;分别从基因及蛋白水平检测UPS标志物-蛋白酶体亚基蛋白酶体亚基C2及mTOR的表达。结果 EGFR-TKI耐药组CT-L活性显著高于EGFR-TKI敏感组,差异有显著性(P<0.05);免疫组化检测蛋白酶体亚基C2在EGFR-TKI耐药组的阳性率为73.5%,显著高于EGFR-TK1敏感组的19.7%(P<0.05);mTOR的表达在EGFR-TKI耐药组的阳性率为77.6%,显著高于EGFR-TKI敏感组的25.6%(P<0.05);蛋白酶体亚基C2与mTOR的表达呈正相关(r_s=0.8)。结论 UPS在肺腺癌EGFR-TKI耐药过程中发挥重要作用,其作用与mTOR的增高相关,为逆转耐药和个体化治疗提供了新思路。

PSME2和STAT3双重抑制通过合成致死效应诱导食管鳞癌细胞死亡

蛋白酶体激活物复合物亚基2(proteasome activator complex subunit 2,PSME2)表达异常与多种肿瘤发生发展密切相关,但在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中功能及临床意义尚不明确。本研究分析了TCGA-ESCC和GSE53625数据库中ESCC转录物组数据,发现PSME2高表达组ESCC患者预后不良,且ESCC组织中PSME2蛋白表达水平高于癌旁组织。沉默KYSE30细胞和NE6-T细胞中PSME2表达,ESCC细胞的增殖、侵袭、迁移和克隆能力均显著下降,同时伴随着LC3-II/LC3-I蛋白表达明显升高、p62蛋白表达降低和自噬激活。GSEA富集分析表明,PSME2低表达组IL-6/STAT3信号通路激活,沉默KYSE30细胞和NE6-T细胞诱导了IL-6分泌和p-STAT3表达增加。上述PSME2沉默诱导的分子变化,能够被LMT28或WP1066逆转。PSME2沉默联合WP1066,使KYSE30与NE6-T细胞培养上清中LDH含量明显升高,Calcein/PI染色表明,死亡细胞率分别为36.69%和32.55%,显著高于PSME2沉默(6.78%和6.74%)或WP1066单独处理组(18.34%和9.70%)。本研究表明,PSME2促进ESCC恶性进展,PSME2沉默通过IL-6/STAT3信号通路代偿性激活ESCC自噬,联合PSME2沉默和STAT3抑制通过合成致死效应诱导食管鳞癌细胞死亡,表明PSME2是ESCC潜在分子治疗靶点,联合抑制PSME2和STAT3是ESCC治疗的新选择。

猪传染性胃肠炎病毒Nsp2与宿主细胞蛋白PSMD11相互作用的研究

为确定猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)与宿主细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11(PSMD11)之间是否存在相互作用,本研究利用RT-PCR方法扩增猪源PSMD11基因,并构建其真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11,经测序和双酶切验证正确后,转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11是否能在IPEC-J2中表达。利用免疫共沉淀(Co-IP)试验检测TGEV Nsp2和宿主细胞PSMD11蛋白之间的相互作用,并通过激光共聚焦显微镜观察TGEV Nsp2与PSMD11在宿主细胞中的共定位情况。结果显示,本研究成功扩增了猪源PSMD11基因,大小约为1474 bp,基因序列经测序比对与标准序列完全一致。构建的真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11能在IPEC-J2细胞中成功表达PSMD11蛋白;Co-IP结果表明,PSMD11与Nsp2之间存在相互作用;共定位试验结果显示,PSMD11与Nsp2的相互作用发生在细胞质中,且细胞中PSMD11蛋白的表达位置并未因Nsp2的表达而发生改变。本研究结果为进一步研究TGEV Nsp2在病毒感染过程中所发挥的重要作用提供新的线索。

日本血吸虫蛋白酶体α2亚基基因的克隆、表达及功能分析

26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物,它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank Accession No.AY813725),序列分析表明该基因的开放阅读框(ORF)含708bp,编码235个氨基酸,理论分子量25.84kDa。同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基,命名为SjPSMA2。实时定量PCR分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d虫体中都有表达,7d和23d虫体表达量低于其他几个时期。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,诱导产生了较高的特异性抗体水平及12.33%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率。SjPSMA2基因及其表达产物的获得,为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。

年龄相关性白内障晶状体前囊膜20s蛋白酶体α2亚基表达及意义

目的年龄相关性白内障（ARC）患者晶状体混浊程度及核的硬度与20s蛋白酶体α2亚基的蛋白表达水平及意义的关系。方法于2015年3月至2016年7月在弋矶山医院眼科收集行超声乳化或小切口白内障摘除术的前囊膜120例（核性60例，皮质性60例）。根据晶状体核的硬度及混浊程度进行分组，核性组分为A组：年轻核，B组：老核；皮质组分为A组：轻度混浊，B组：重度混浊。两种类型白内障中以A组为实验组，B组为对照组；并应用western-blot测定20s蛋白酶体α2亚基在两组ARC患者晶状体前囊膜中的表达水平。结果与A组相比较，B组20s蛋白酶体α2亚基表达水平明显降低，核性（0.99±0，02）VS（0.58±0.08）差异有统计学意义（P〈0.01），皮质性（1.26±0，15）VS（0.89±0.09）差异有统计学意义（P〈0.05）。ARC患者晶状体混浊程度及核的硬度与20s蛋白酶体α2亚基含量呈显著负相关。结论ARC患者前囊膜中20s蛋白酶体α2亚基的蛋白表达含量随晶状体混浊程度及核的硬度加深而降低。