猪瘟病毒NS3丝氨酸蛋白酶功能区基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

用RT PCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株非结构蛋白NS3丝氨酸蛋白酶功能区 [即NS3 (ΔC) ]基因cDNA ,将之克隆到 pGEMT载体测定其核苷酸序列 ,并推导出其对应氨基酸序列 ,结果表明这两个毒株间的NS3 (ΔC)区基因核苷酸序列同源性为95 8% ,氨基酸序列同源性为 99% ,有 2个残基的差异 ;两毒株与一些猪瘟病毒以及同属的牛病毒性腹泻病病毒代表毒株的对应序列进行比较 ,所测核苷酸序列及推导的氨基酸序列均极为保守 ,而且氨基酸序列分析结果还表明 ,瘟病毒NS3 (ΔC)序列也含有与其它黄病毒同样保守的由His,Asp和Ser残基构成的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三分体 ,三分体中Ser为丝氨酸蛋白酶催化活性关键氨基酸残基 ;将上述NS3 (ΔC)基因亚克隆至原核表达载体pET 2 8a中 ,并在E .coli中获得高效表达 ,将表达产物纯化并免疫小鼠 ,间接免疫荧光和Westernblot结果表明制备了针对NS3(ΔC)蛋白的多克隆抗体。上述实验结果为继续深入研究非结构蛋白NS3在猪瘟病毒的复制及病毒与宿主细胞相互关系中的作用 。

功能蛋白酶催化及应用进展

蛋白酶广泛存在于动物、植物及微生物体内,在生物体内的代谢和合成过程中发挥着重要作用,也是一种重要的工业酶制剂,其中,微生物蛋白酶几乎占据着全球商业蛋白酶的三分之二。随着生物技术的兴起,蛋白酶在各个领域的应用日益广泛,通过酶工程改造和基因工程菌株构建获得高稳定性的蛋白酶是其工业应用的关键。本文首先对功能蛋白酶的来源进行了分析,进一步对功能蛋白酶的类型、功能及其作用机制进行了阐述;然后综述了部分重要功能蛋白酶的酶工程改造和基因工程菌株构建方法;最后总结了功能蛋白酶的应用领域并提出了未来重要功能蛋白酶的应用方向。

散发性帕金森病蛋白酶体功能障碍及其所致的路易(小)体形成

散发性帕金森病(sporadic Parkinson's disease,sPD)的主要病理特征之一是中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)残存多巴胺能神经元内核周路易(小)体(Lewy body,LB)形成.LB发生的具体原因和确切过程有待进一步阐释.来自遗传学、尸体解剖和实验科学的报道提示,蛋白酶体功能障碍及其所致的LB形成可能是按照聚集体形成途径(process of aggresomes)进行的.在聚集体形成途径过程中,异常蛋白质聚集基本上经历了非纤维化分子聚集过程(molecular crowding)以及后续的纤维化聚集过程(fibrilation of aggregation).其间,蛋白酶体功能障碍(dysfunction of proteasome)、内质网相关降解丧失(loss of endoplasmic reticulum associated degradation)、非纤维化聚集物(nonfibrilar aggregates)、聚集体(aggresomes)及至纤维化LB(fibrilar LB)等构成了sPD病变过程的主要事件.这提示在sPD病变过程中,蛋白酶体功能障碍及其所致的LB形成过程实质上是细胞信号的转导过程,其间涉及了众多的蛋白质分子.

多巴酚丁胺联合中医治疗对小儿重症肺炎患儿炎症因子及基质金属蛋白酶功能水平的影响

目的 探讨多巴酚丁胺联合中医治疗对小儿重症肺炎患儿炎症因子及基质金属蛋白酶功能水平的影响。方法 选取2017年3月-2019年5月该院收治的重症肺炎患儿90例为研究对象,随机分为对照组和观察组,每组各45例。对照组采用中医针灸治疗,观察组在对照组基础上联合多巴酚丁胺治疗,治疗1个月后评估患儿治疗效果,比较两组患儿症状体征改善时间、炎症因子水平变化及基质金属蛋白酶功能水平变化情况。结果 治疗1个月后,观察组患儿退热时间、心率好转时间、呼吸好转时间及肺部啰音好转时间均低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0. 05);观察组患儿白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-8 (IL-8)、C-反应蛋白(CRP)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平均低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0. 05);观察组患儿MMP9、MMP9/TIMP1水平低于对照组,TIMP1水平高于对照组,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论重症肺炎患儿采用多巴酚丁胺联合中医针灸治疗,有利于患儿临床症状改善,能够降低炎症因子IL-6、IL-8、CRP及TNF-α水平,恢复基质金属蛋白酶与金属蛋白酶抑制剂的平衡,值得推广应用。

植物体内的多功能蛋白酶——谷胱甘肽转移酶

谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)在植物体内普遍存在,是由一个大的多基因家族编码的多功能蛋白酶。GSTs的表达受多种环境因子的诱导,在植物的生长发育、次生代谢和耐逆中有重要作用。本文简要介绍了GST的研究概况,重点讨论了其生理功能。

含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子在心血管疾病中的研究进展

细胞凋亡在维持机体正常发育以及内环境稳定中发挥重要作用,同时也对多种疾病的病理生理产生影响。研究表明心肌细胞凋亡参与了多种心血管疾病的发生发展过程。含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子(ARC)是迄今为止唯一在心脏特异性高表达的抗凋亡蛋白,并可通过其抗凋亡能力发挥心肌保护作用。本文就ARC的结构和特点、ARC在心血管疾病中的作用及机制予以综述。

散发性帕金森病蛋白酶体功能障碍及其所致的路易(小)体形成

目的:探讨蛋白酶体功能障碍及其所致的路易(小)体形成对散发性帕金森病发病机制的影响效果,为明确散发性帕金森病发病机制提供可靠依据。方法:研究组给予蛋白酶体抑制剂注射;对照组给予生理盐水注射。指定具有专业知识及丰富经验的相关技术人员完成两组大鼠本次实验过程。记录路易(小)体形成率及黑质部位α-Sun蛋白表达情况,给予统计学分析后得出结论。结果:研究组α-突触核蛋白(α-Syn)与β-肌动蛋白(β-actin)比值显著高于对照组(P<0.05);两组大鼠实验前路易(小)体形成率对比结果无统计学意义(P>0.05),经不同方法处理后研究组路易(小)体形成率(94.00%)显著高于对照组(4.00%)及本组实验前(2.00%)(P<0.05)。结论:蛋白酶体功能障碍是导致α-Syn聚集及路易(小)体形成的主要原因,也是发生散发性帕金森病的危险因素,应引起相关医护工作者高度重视。

顶复门原虫类枯草杆菌蛋白酶SUB1的研究进展

类枯草杆菌蛋白酶-1(subtilisin-like protease,SUB1)是一种绝大多数顶复门原虫所必需的蛋白酶,SUB1广泛参与顶复门原虫的粘附、入侵、复制和逸出等多个生命活动。研究发现,SUB1属于丝氨酸蛋白酶家族,催化结构域保守,具有高度的专一性,并与虫体的运动和毒力相关。本文对已发现的顶复门原虫类枯草杆菌蛋白酶SUB1的结构和功能做一综述。

大多功能蛋白酶7基因多态性与1型糖尿病易感性的关系

目的 研究大多功能蛋白酶 (LMP) 7基因与 1型糖尿病 (DM )易感性的关系。方法采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性技术对 71例 1型DM患者及 86例正常对照进行LMP7基因分型。根据发病年龄将 1型DM患者分为 3组 ,A组≤ 14岁 ,B组 15～ 30岁 ,C组≥ 31岁。结果 1型DM组LMP7 B/B频率较对照组显著降低 (39%vs 5 8% ,P <0 .0 5 ) ,LMP7 B/A频率显著升高 (5 4%vs 31% ,P <0 .0 1)。LMP7各基因型及等位基因频率在糖尿病各发病年龄组间差异无显著性。结论 LMP B/B可能是 1型DM的保护基因型 ,携带该基因型的人群患者 1型DM危险性降低。LMP7 B/A可能是 1型DM的易感基因型 ,携带该基因型的人群患 1型DM危险性增加。LMP7基因与

大多功能蛋白酶2基因Arg60His变异与上海地区自身免疫性甲状腺病的相关性

目的 探讨大多功能蛋白酶 2 (LMP2 )基因Arg60His变异与上海地区中国人自身免疫性甲状腺病 (AITD)的关系。方法 运用限制性片段长度多态性PCR(PCR RFLP)技术在 367例无亲缘关系的上海地区中国人 [正常对照 1 62例 ;AITD者 2 0 5例 ,其中促甲状腺激素受体抗体 (TRAb)阳性者 78例 ,TRAb阴性但在甲状腺球蛋白抗体 (TGAb)、甲状腺微粒体抗体 (TMAb)或甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)中至少有 1项阳性者 1 2 7例 ]中检测LMP2基因Arg60His变异。结果 上海地区汉族人 (R0 89,H 0 1 1 )与白种人 (R 0 2 9,H 0 71 )LMP2基因R/H 60等位基因频率分布有显著差异 (P =0 0 0 0 )。AITD中TRAb阳性亚组与正常对照组间基因型及等位基因分布频率均有显著差异 ,TRAb阳性亚组RH基因型和H等位基因频率显著高于正常对照组 (P值分别为 0 0 37,0 0 4 7)。AITD其他抗体阳性亚组与抗体阴性亚组间基因型及等位基因频率分布无显著差异。

探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森病发病机制的影响

目的探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森病的发病机制。方法收集本院2013年7月~2015年7月病例,将存在蛋白酶体功能障碍的帕金森病患者50例作为观察组,未存在蛋白酶体功能障碍的帕金森病患者50例作为对照组,观察2组患者的行为学改变情况,通过RT-PCR、Western blotting分子生物学方法检测患者血液中α-突触核蛋白(α-Syn)表达水平。结果观察组患者血清的α-突触核蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论蛋白酶体功能障碍可能导致散发性帕金森病患者血液中α-突触核蛋白(α-Syn)水平升高,考虑该因素可能是散发性帕金森疾病的危险因素。

人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的研究进展

人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase,hNE)是一种丝氨酸蛋白水解酶,主要分布于中性粒细胞中。当体内抗hNE蛋白与hNE的平衡被打破,过量释放的hNE会导致相关疾病的发生,因此抑制hNE是一种很有前途的疾病治疗策略。本文简要介绍了hNE的结构、作用机制、生理功能及hNE抑制剂的研发现状,以期能为相关研究提供参考。

LMP基因多态性及其在母胎间共享与子痫前期相关性研究

目的:探讨孕妇及胎儿巨大多功能蛋白酶体(LMP)基因多态性及母胎LMP共享与重度子痫前期的关系。方法:利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对2006年7月至2010年8月于我院住院治疗的77例重度子痫前期母胎和200例正常妊娠母胎的LMP2、LMP7基因进行多态性对应分析。结果:(1)LMP2-R/R、LMP7-B/B在重度子痫前期组孕妇分布频率明显低于对照组,LMP2-R/H在重度子痫前期组孕妇分布频率明显高于对照组,OR值分别为0.211,0.238,4.594;(2)LMP2及LMP7共12种等位基因型在重度子痫前期组和对照组胎儿间分布的差异无统计学意义;(3)母胎间共享一个基因重度子痫前期组明显低于对照组,共享四个基因型者重度子痫前期组明显高于对照组,OR值分别为0.051和5.360。结论:LMP2-R/H可能是重度子痫前期的易感基因,LMP2-R/R、LMP7-B/B可能是重度子痫前期的保护基因。母胎LMP基因共享率高对重度子痫前期的发生可能是独立因素。

LMP、TAP基因多态性与自身免疫病关系的研究进展

内源性抗原的处理与提呈及其导致的自身免疫紊乱被认为是自身免疫病的发病机制之一。在ＨＬＡ－Ⅱ类基因区域发现的两种新的基因:巨大多功能蛋白酶(ＬＭＰ)和抗原处理相关运转体(ＴＡＰ)基因被认为与内源性抗原的处理、提呈密切相关。对ＬＭＰ、ＴＡＰ基因多态性与自身免疫病的关系的研究,认为它们可能为独立于ＨＬＡ基因之外的另一自身免疫病的易感/保护基因。

ARC基因沉默对缺氧诱导持续性肺动脉高压小鼠的影响

目的探讨带有Caspases富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)基因沉默对缺氧诱导持续性肺动脉高压(PPH)小鼠的影响。方法18只新生C57BL/6小鼠随机分为对照组、PPH组和ARC沉默组,每组6只。PPH组和ARC沉默组采用12%O_(2)诱导构建PPH模型后,ARC沉默组小鼠尾静脉注射短发夹RNA-ARC重组腺相关病毒100μL,PPH组小鼠尾静脉注射生理盐水100μL,每天1次,注射14 d。测定小鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI),HE染色观察肺血管形态,计算血管壁厚度占血管外径百分比(WT%),TUNEL染色观察肺动脉壁细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测凋亡因子的表达情况。结果与对照组比较,PPH组和ARC沉默组RVSP、RVHI、WT%升高(P<0.05),肺动脉壁细胞凋亡数减少(P<0.05),Caspase-3和Bcl-2基因相关启动子mRNA表达降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达增加(P<0.05);与PPH组比较,ARC沉默组RVSP、RVHI和WT%降低(P<0.05),肺动脉壁细胞凋亡数增多(P<0.05),Caspase-3和Fas相关死亡域蛋白mRNA表达增加(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达下降(P<0.05)。结论ARC基因沉默能够抑制缺氧诱导PPH小鼠肺血管重塑,促进肺动脉壁细胞凋亡。

LMP2基因多态性及夫妻共享率与重度子痫前期的相关性研究

目的 测定重度子痫前期（severe pre-eclampsia，S-PE）患者和正常孕妇多功能蛋白酶（large muhifunctional protease，LMP2）基因多态性及夫妻共享率，探讨该基因与S-PE发病的相关性。方法 选择102例S-PE患者及其配偶为研究对象，随机选择200例正常孕妇及其配偶作为对照。所选孕妇均为单胎初孕，孕35～40周。各取2ml外周静脉血抽提DNA，应用PCR—RFLP方法进行LMP2基因分型。结果 LMP2R／H在S-PE患者中的分布频率显著高于正常孕妇组（53．9％和35．5％，P〈0．01），LMP2R／R在S-PE患者中的分布频率显著低于正常孕妇组（41．2％和58．5％，P〈0．01）。LMP2R／H在S-PE组的夫妻共享率与正常孕妇组的相比显著增高（24．5％和10．5％，P〈0．01）。结论 LMP2R／H很可能为S-PE发病的易感基因；而LMP2R／R可能是S-PE的保护基因。