蛋白质错误折叠循环扩增技术

目前发现有多种人类及动物疾病是由体内蛋白质的错误折叠引起的,其中朊毒粒病因具有传染性而备受关注。朊毒粒病研究的核心问题之一是正常细胞朊蛋白(PrPc)向异常致病朊毒粒(PrPSc)转变的机制。蛋白质错误折叠循环扩增技术(protein misfolding cyclic amplification,PMCA)就是最新发明的在体外诱导朊蛋白(PrPc)产生错误折叠生成朊毒粒(PrPSc)的技术。该文将概要介绍此项技术的原理、技术要点及在诊断与基础研究方面的应用前景。

22L毒株朊蛋白错误折叠循环扩增方法的建立

参考Saborio和Soto创建的名为蛋白质错误折叠循环扩增(protein misfolding cyclic amplification,PMCA)的方法建立一种22L毒株系朊蛋白错误折叠循环扩增方法,以便研究22L毒株系异常朊蛋白(scrapie PrP,PrPSc)的合成机制。在阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)存在的条件下,这种方法可以通过超声降解从而重复扩增产物,并在仓鼠脑匀浆中快速有效的模仿体内朊病毒PrPSc的复制,因此可以在几个小时内高浓度扩增PrPSc。已有试验结果发现,PrPSc体外转化率在使用粗提的脑组织匀浆时比使用纯化重组PrP更高,这个发现暗示着高效率的PrPSc转化可能还需要探索其他未知的宿主因素。研究结果表明,建立的这种改良的PMCA技术可用于研究PrPSc合成的生物化学机制,以此来进行诊断与治疗方法的研究。

循环扩增误折叠蛋白可检测朊毒体

朊毒体是传染性海绵样脑病的病原,主要由糖蛋白PrP^(Sc)组成,PrP^(Sc)由正常细胞表面蛋白PrP^C异构而成。从感染朊毒体到出现临床症状,极微量的PrP^(Sc)即可将宿主PrP^C不断转变为PrP^(Sc),最后导致患者大脑中大量PrP^(Sc)聚集。目前众多检测方法均因非脑组织中PrP^(Sc)含量过少而受限,以致延误诊治。本文作者报道通过循环扩增误折叠蛋白,大量PrP^C在微量 PrP^(Sc)存在下转变为PrP^(Sc)类似物(PrPres),从而能在非脑组织中早期检出微量PrP^(Sc)。

一种朊蛋白错误折叠循环扩增方法的建立

目的建立一种类似于PCR的蛋白质扩增方法-蛋白错误折叠循环扩增技术（PMCA），用于朊病毒病脑组织中PrP^sc的检测。方法将不同浓度的羊瘙痒因子263K毒株原液与正常仓鼠脑组织匀浆混合，经反复孵育／超声，共10～15个循环。Western Blot检测扩增产物中蛋白酶K抗性PrP^sc信号。结果在本研究试验体系下，263K毒株可以利用仓鼠脑组织为基质在体外迅速复制。所建立的PrP^sc-PMCA技术可检测到10^-5稀释的毒株原液中的PrP^sc。与常规的脑组织免疫印记方法相比，敏感度提高了10^5～10^6倍。研究还显示PrP^sc。还可利用小脑和脑于为基质进行体外扩增复制。结论成功建立了PrP^sc-PMCA技术，为朊病毒病的早期诊断和朊病毒生物学特性的研究提供了一种新的手段。

蛋白质错误折叠循环扩增技术及其应用

可传播性海绵状脑病是一类由朊病毒侵袭中枢神经系统而引起的致死性神经退行性疾病。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrPC(cellular PrP)转化为异常构象的PrPSc(scrapie PrP)是至关重要的。目前,PrPSc转化增殖及致病机理仍不清楚。蛋白质错误折叠循环扩增(protein misfolding cyclic amplification,PMCA)技术的出现和应用,为研究朊病毒病的发病机制和发展敏感性高、特异性强的检测方法提供了很好的技术平台。

一种基于连续PMCA的PrP^Sc体外扩增方法的建立

为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测。结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制。连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc。

蛋白质错误折叠循环扩增及其在朊病毒蛋白检测中的应用研究进展

朊病毒蛋白(prion protein,PrP)是传染性海绵状脑病的病原体,其检测是该病诊断的重要依据。该文从原理、方法、影响因素和检测应用方面对蛋白质错误折叠循环扩增(protein mis-folding cyclic amplification,PMCA)这种朊病毒蛋白新型检测技术做了介绍,旨在为朊病毒蛋白的检测和发病机制研究提供理论参考。

朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析

朊蛋白体外扩增技术包括实时震动诱导蛋白扩增(Real-time quaking-induced conversion,RT-QuIC)技术及蛋白错误折叠循环扩增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)技术。为了分析朊蛋白体外扩增技术与传统的蛋白免疫印迹技术对于朊病毒毒株检测敏感性的差异,应用此三种方法对朊病毒小鼠适应株139A、ME7和S15以及仓鼠适应株263K毒株进行了检测及对比分析。结果显示,应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,均可检测到10-9稀释度139A小鼠脑匀浆中的朊病毒,比Western blot方法敏感度提高了106倍;应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,分别可检测到10-7稀释度及10-8稀释度ME7小鼠脑匀浆中的朊病毒,分别比Western blot方法敏感度提高了104倍及105倍;应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,分别可检测到10-8稀释度及10-9稀释度S15小鼠脑匀浆中的朊病毒,分别比Western blot方法敏感度提高了105倍及106倍;应用RT-QuIC方法可检测到10-9稀释度263K仓鼠脑匀浆中的朊病毒,比Western Blot方法敏感度提高了106倍,但三轮PMCA扩增方法可检测到10-3稀释度的263K小鼠脑匀浆中的朊病毒,与Western Blot方法比较敏感度没有明显提高。本实验为优化朊蛋白体外扩增技术的检测条件、检测敏感性及该技术的临床应用提供了实验数据参考。

利用PMCA技术实验不同剂量MCT联合DTT对PrP^(sc)转化的抑制效应

蛋白质错误折叠循环扩增(protein misfolding cyclic amplification,PMCA)技术,是一种具有感染性的朊蛋白(PrPsc)体外扩增的技术,可用于抑制细胞型朊蛋白(PrPc)向PrPsc转化药物的筛选.本研究在Saborio等提供的方法基础上,成功优化了最佳扩增时间,利用优化的PMCA技术实验了不同剂量氮芥(mechlorethamine,MCT)联合二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)对PrPsc转化的抑制效应.结果发现,MCT联合DTT能体外抑制PrPc向PrPsc的转化,抑制作用具有明显的量效关系.利用针对人PrPc不同结构域的抗体发现,MCT联用DTT可使抗体6H4的抗原表位隐蔽,该表位位于PrPc第1个α螺旋区内,是构象转化的主要部位.对其机制的深入探讨,将有助于新一类可传播性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy,TSE)治疗药物的研发.

蛋白质自组装及分析应用

蛋白质分子自组装广泛存在于真核及原核细胞中,对维持生命体系正常运转、促进生命体进化至关重要。本文重点介绍了淀粉样纤维蛋白的基本特性、蛋白错误折叠循环扩增技术的研究背景、原理及其在生物活性物质检测上的应用,并对蛋白纳米材料的制备及其在生物分析、细胞成像等方面的研究进展进行了评述。

蛋白质体外扩增技术在神经退行性疾病诊断中的应用

神经退行性疾病患者被诊断时通常已经处于疾病晚期,该类疾病的诊断主要取决于临床症状的鉴别,给诊断造成一定的困难。目前已经逐渐开始尝试对神经退行性疾病进行早期诊断。蛋白质体外扩增技术包括蛋白质错误折叠循环扩增(Protein Misfolding Cyclic Amplification, PMCA)和实时震动诱导转化(Real-time Quaking-induced Conversion, RT-QuIC),是用于检测错误折叠的蛋白质聚集体的超灵敏蛋白质扩增法。随着该类技术不断地改进,目前已逐渐应用于朊病毒病、突触核蛋白病、阿尔茨海默病和皮克氏病等疾病中错误折叠蛋白的检测。PMCA和RT-QuIC技术在临床症状出现前的早期阶段也显示出很高的检测灵敏度和特异性,并且可以进行鉴别诊断,这两种检测手段作为实验室辅助诊断方法,具有巨大的应用前景。

克雅氏病的实验室检测技术研究进展

克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)是一种在人类中最为常见的海绵状脑病,其致病因子为朊病毒。由于该病的致死率为100%,且具有传播风险,CJD的早期诊断对疾病防控具有重要意义。临床上一般依据患者的临床症状与体征以及相应的实验室检测来进行CJD的鉴别诊断。本文主要围绕现有的CJD实验室检测技术展开综述,包括朊病毒的直接与间接检测、疾病标志物的检测以及疾病相关基因PRNP的检测与分析等,旨在为进一步推广和规范CJD的实验室检测提供参考与技术依据。

“显性负效应的研究进展

显性负效应(dominant negative,DN)是一种生物体内普遍存在的负调节现象。有DN效应的分子可以是蛋白质,也可以是核酸;可由突变产生,也可自然存在。DN效应涉及配体、受体、转录因子、结构蛋白、酶、信号通路蛋白、离子通道等多种功能蛋白,并包括微卫星DNA扩增与蛋白质错误折叠等比较特殊的现象。DN效应与多种疾病的发病机制密切相关。本文将就DN效应的作用机制、来源、对机体的影响等方面结合实例进行综述。

朊病毒“类PCR”高灵敏度检测方法的研究进展

朊病毒是传染性海绵状脑病的感染因子,主要由错误折叠的朊蛋白(PrPS)c组成。朊病毒的复制就是在痕量PrPSc的催化下,正常朊蛋白(PrPC)向其错误折叠形式的转化。本文介绍的是朊病毒的新型检测方法,即蛋白质错误折叠循环扩增技术(类"PCR"高灵敏度检测方法),这种技术的概念是根据朊病毒的复制原理形成的,其方法类似于DNA通过PCR扩增的方法。本文针对朊病毒"类PCR"高灵敏度检测方法中几个具有代表性意义的技术作一综述。

克雅病早期诊断生物标志物的研究进展

克雅病是一类由具有传染性的致病朊蛋白所致的致死性中枢神经系统变性疾病。该病早期临床表现多样,缺乏特异性,难以与其他中枢神经系统疾病相鉴别。目前,研究者们在克雅病的影像学、脑电图、脑脊液特殊蛋白检测等方面已经进行了长期的探索和临床实践,而近年来的致病朊蛋白检测新方法的发展更是为该病的早期诊断提供了巨大帮助,具有着极大的临床应用前景。笔者现围绕近年来克雅病的流行病学及分型、病因及病理机制,尤其是其早期诊断生物标志物等方面的研究进展进行综述,以期帮助临床同道进一步提高对克雅病的认识。

SMB-S15细胞中朊病毒PMCA方法的建立及对白藜芦醇抗朊病毒作用的评价

朊病毒是一类能引起人或动物神经退行性疾病的感染因子。蛋白质错误折叠循环扩增(Protein misfolding cy-clic amplification,PMCA)是一种常见的朊病毒体外扩增技术。白藜芦醇是一种具有较高研究价值的植物抗菌素。为了建立SMB-S15细胞中朊病毒的PMCA体系,并探索PMCA技术在评价白藜芦醇抗朊病毒作用的意义,本研究以朊病毒感染细胞系SMB-S15细胞匀浆为种子,健康小鼠脑组织匀浆为底物,建立PMCA技术平台。将不同浓度的白藜芦醇导入PMCA体系,通过Western Blot方法检测PMCA产物中异常朊蛋白(PrPSc)的生成和变化。结果显示:SMB-S15细胞中PrPSc可以在建立的PMCA体系有效地复制。新生成的PrPSc分子的糖基化特征与原始细胞中的PrPSc不同,其双糖基化分子比例明显增加。同时也有别于羊瘙痒因子139A和ME7感染小鼠脑组织中的PrPSc分子。加入白藜芦醇后,PrPSc在PMCA体系中的复制明显被抑制,呈现出剂量依赖效应,其EC50约为4.616μM。这些结果表明:SMB-S15细胞中的PrPSc可以通过PMCA大量扩增,建立的PMCA技术可有效地反映白藜芦醇对PrPSc在体外复制的抑制作用。