蛋白4.1R对肝细胞HL-7702增殖、凋亡以及糖酵解的影响

目的探究蛋白4.1R对肝细胞增殖、凋亡以及糖酵解的影响,并初步阐明其分子机制。方法以肝细胞株HL-7702为材料,利用CRISPR/Cas9技术构建4.1R^(-/-)HL-7702细胞株。设置对照组为正常培养的4.1R+/+HL-7702细胞,实验组为4.1R^(-/-)HL-7702细胞。细胞在培养24、48以及72 h时,分别用CCK-8及EdU-488染色,然后利用酶标仪以及流式细胞术检测细胞的增殖能力。细胞经Annexin V-FITC/PI染色后,流式细胞术检测HL-7702细胞在培养24、48以及72 h时的凋亡水平。利用生化试剂盒分别检测HL-7702细胞葡萄糖摄取量、乳酸分泌量以及ATP生成的变化。pH计检测培养48 h HL-7702细胞上清培养基的pH值。qRT-PCR检测HL-7702细胞糖酵解过程关键调节酶HK2、PFKL、PKM2以及LDHA的mRNA表达量。Western blotting检测AMPK、p-AMPK、Raptor以及p-Raptor的蛋白表达量。结果Western blotting以及基因测序结果表明4.1R^(-/-)HL-7702细胞株构建成功。与对照组相比,4.1R^(-/-)组的CCK-8和EdU-488实验结果均显示HL-7702细胞的增殖能力降低;细胞凋亡实验结果表明,4.1R^(-/-)HL-7702细胞凋亡水平升高。蛋白4.1R的缺失导致HL-7702细胞葡萄糖摄取量(P<0.05)、乳酸分泌量(P<0.001)、ATP生成(P<0.001)下降,细胞上清培养基pH值(P<0.01)升高。qRT-PCR实验结果表明糖酵解过程关键调节酶的mRNA表达量均下降(P<0.001)。相较于HL-7702细胞,4.1R^(-/-)HL-7702细胞的AMPK和Raptor蛋白表达量下降,p-AMPK和p-Raptor蛋白表达量升高。结论蛋白4.1R的缺失导致HL-7702细胞增殖能力降低、凋亡水平增加,糖酵解过程被抑制,其调控机制与下游AMPK-mTORC1信号通路的激活密切相关。

细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin在胃癌中的表达及其临床意义

目的探讨胃癌组织、癌旁胃组织中细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin在胃癌转移扩散中的作用及三者间的相互关系。方法收集52例胃癌标本(腺癌)、30例距癌组织边缘10 cm以上的癌旁胃组织标本作为对照。应用免疫组织化学Elivision法检测这些组织中的细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的蛋白表达情况。结果胃癌组织中细胞骨架蛋白4.1N、E-cadherin及β-catenin蛋白表达明显低于对照组(P<0.05);低分化胃癌组织中细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的蛋白表达较高-中分化胃癌组织表达显著降低(P<0.05);细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的蛋白在无淋巴结转移的胃癌组与有淋巴结转移的胃癌组间比较差异有统计学意义(P<0.05);细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的蛋白在胃癌组织中的IOD值随着TNM分期的增高而降低,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin的蛋白的表达与胃癌患者的年龄、性别无关(P>0.05);细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin(r=0.381,P<0.05)、E-cadherin与β-catenin(r=0.571,P<0.05)、细胞骨架蛋白4.1N与β-catenin(r=0.602,P<0.05)之间均呈正相关关系。结论细胞骨架蛋白4.1N与E-cadherin、β-catenin在胃癌中的表达呈正相关,三者在胃癌发生发展中可能具有重要的协同作用。

蛋白4.1家族在不同乳腺癌细胞株中的表达与定位

背景与目的:目前,已在多种人类肿瘤中发现蛋白4.1家族成员表达异常。本研究旨在通过检测蛋白4.1家族成员(4.1R/B/G/N)在3株转移能力不同的人乳腺癌细胞株MCF-7、T-47D和MDA-MB-231中的表达和定位,探讨蛋白4.1家族成员与乳腺癌细胞转移能力之间的关系。方法:采用Westernblot检测蛋白4.1家族成员在MCF-7、T-47D和MDA-MB-231细胞中的表达;免疫荧光标记对蛋白4.1家族成员在3株细胞中的表达进行定位。结果:4.1R/B/G在3种细胞系中均有表达,在T-47D细胞中的表达量均明显高于在MCF-7细胞中的表达量(P<0.05);但在高转移性的MDA-MB-231细胞中它们的表达水平转而下降。4.1N在T-47D细胞中的表达量明显低于在MCF-7细胞中的表达量(P<0.01),而在MDA-MB-231细胞中的表达则几乎检测不到,提示4.1N表达下调或缺失与乳腺癌细胞转移能力密切相关。4.1R/B/G/N在MCF-7和T-47D细胞中均主要定位于细胞膜及胞间连接处,同时4.1B在细胞核中也有表达;而在高转移的MDA-MB-231细胞中蛋白4.1家族成员均定位于细胞质中,提示蛋白4.1家族成员亚细胞定位的改变可能是乳腺癌细胞转移过程中的重要事件。结论:4.1N表达缺失和蛋白4.1家族成员亚细胞定位的改变与乳腺癌细胞MDA-MB-231的高转移性密切相关。

重症肌无力伴胸腺瘤患者胸腺组织蛋白4.1R mRNA的表达研究

目的探讨蛋白4.1R在重症肌无力(myasthenia gravis,MG)伴胸腺瘤患者胸腺组织中的表达情况。方法运用半定量RT-PCR方法检测7例胸腺瘤MG与7例正常对照组胸腺组织中蛋白4.1R的表达。结果胸腺瘤MG组胸腺组织中蛋白4.1R mRNA的相对表达水平为0.84±0.46,与对照组0.43±3.69相比明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论蛋白4.1R在胸腺瘤MG患者胸腺组织中mRNA水平表达异常,可能干扰胸腺细胞的信号传导,从而影响胸腺细胞的增殖和活化,参与了MG的发生。

蛋白4.1R基因敲除小鼠的引种及繁殖

目的:引种、繁殖4.1R基因敲除小鼠,用于蛋白4.1R功能的研究。方法:按照国家进出境动物检验检疫的具体要求,对引种自美国的3对4.1R基因敲除小鼠进行隔离、检疫。引进的种鼠按照SPF动物饲养标准操作规程在IVC屏障系统中进行1雄1雌长期同居方式繁殖,C57BL/6J对照组小鼠采用同样方式饲养繁殖。定期观察记录种鼠的繁殖率、仔鼠出生率及成活率。比较基因敲除小鼠与野生型小鼠体质量变化。提取仔鼠尾组织基因组DNA,用PCR法进行基因型鉴定。结果:经隔离检疫,3对4.1R敲除小鼠符合我国SPF小鼠的微生物控制级别。23只繁殖仔鼠基因型PCR鉴定结果为基因敲除纯合子,雌鼠产仔率100%,平均胎产仔5.8只,仔鼠成活率74%。基因敲除小鼠平均体质量与野生型小鼠比较差异无统计学意义(F组间=4.035,P=0.056;F时间=543.723,P<0.001;F交互=4.358,P=0.004)。结论:在国内成功引种和繁殖C57BL/6J-4.1R-/-小鼠。

蛋白4.1家族在小鼠黑色素瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

目的筛选小鼠黑色素瘤细胞中蛋白4.1家族的表达,探讨蛋白4.1对小鼠黑色素瘤细胞增殖的影响。方法以MEF、B16、B16-F10细胞基因组RNA和总蛋白为模板,经PCR法和Western blot筛选蛋白4.1在小鼠黑色素瘤细胞中的表达;通过分子克隆构建真核表达载体p EGFP-N1-EPB41L3并转染黑色素瘤细胞;检测表达蛋白4.1B后B16、B16-F10细胞增殖的变化。结果蛋白4.1B在黑色素瘤细胞中表达缺失;通过转染成功构建的真核表达载体p EGFP-N1-EPB41L3发现,表达蛋白4.1B的黑色素瘤细胞的增殖作用被显著性抑制。结论通过真核表达载体p EGFP-N1-EPB41L3转染表达蛋白4.1B可显著抑制B16和B16-F10黑色素瘤细胞的增殖。

蛋白4.1基因家族的研究进展

近几年 ,先后发现了三种与红细胞中的 4 1蛋白同源性很高的蛋白质 ,这四种蛋白质都具有三个功能性结构域 ,即膜结合结构域 ,血影蛋白 肌动蛋白结合结构域和羧基端结构域 .而且除了已知的在细胞膜物理和生理特性维持方面的重要作用外 ,4 1蛋白还与有丝分裂以及神经突触的形成有关 .

肺小细胞癌组织中4.1蛋白家族的表达

目的:探讨肺小细胞癌组织中4.1蛋白家族的表达情况以及与淋巴结转移的关系。方法:取肺小细胞癌标本41例,采用免疫组织化学Envision+染色法检测4.1蛋白家族的表达情况。以21例癌旁正常组织作为对照。结果:肺小细胞癌组织中4.1R、4.1N和4.1G的阳性表达率低于癌旁正常组织(P<0.05),4.1B在2种组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05);癌组织中4.1N、4.1G和4.1B的表达均与淋巴结转移无关(P>0.05),4.1R的表达与淋巴结转移有关(P<0.05)。结论:4.1蛋白家族成员在肺小细胞癌的发生、发展过程中作用不同。

细胞膜骨架蛋白4.1R对光动力效应的影响

目的 探讨细胞膜骨架蛋白4.1R对光动力效应的影响.方法 将4.1R基因敲除型（4.1R-/-）和野生型（4.1R＋/＋）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分别以0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mmol/L浓度的5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）孵育,72、96、120、180、240mJ/cm2剂量的450 nm蓝光照射进行光动力处理,细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）检测细胞存活率;经不同浓度5-ALA孵育的细胞,以荧光分光光度法检测胞内光敏剂原卟啉的荧光强度;以1.00 mmol/L的5-ALA孵育细胞后激光共聚焦显微镜观察胞内产生的原卟啉在细胞中的定位;Western印迹法检测原卟啉合成限速酶亚铁螯合酶（FECH）与胆色素原脱氨基酶（HMBS）蛋白表达水平.结果 5-ALA光动力处理均能杀伤两种细胞,其杀伤作用与5-ALA的浓度、孵育时间及光照射剂量相关,但两者PDT杀伤效果不同.当1.00mmol/L的5-ALA孵育4.0h且光照射剂量为120mJ/cm2时,4.1R-/-MEF存活率显著高于4.1R＋/＋MEF[（46.9±7.1）％比（12.5±2.1）％,P＜0.001].5-ALA孵育细胞后产生的原卟啉分布于整个胞质中,但两种细胞中原卟啉的浓度不同,在1.00 mmol/L的5-ALA孵育4.0h时,4.1R＋/＋MEF内原卟啉荧光值显著高于4.1R-/-MEF（124.2±3.5比34.6 ±3.8,P＜0.001）.Western印迹结果表明FECH与HMBS在两种细胞中的表达水平差异无统计学意义.结论 蛋白4.1R的缺失造成细胞内原卟啉合成量降低,PDT效果下降,但并未影响ALA代谢过程,推测蛋白4.1R影响了5-ALA的跨膜转运,进而影响细胞内原卟啉的合成,最终影响了PDT杀伤效应.

食管小细胞癌组织中4.1蛋白家族的表达及意义

采用免疫组织化学方法检测食管小细胞癌以及癌旁组织中4.1蛋白家族的4个成员4.1B、4.1R、4.1N、4.1G表达水平。结果发现上述4种蛋白在食管小细胞癌组织中的阳性表达率极低,明显低于癌旁组织(P<0.01),且其表达情况与有无淋巴结转移均无相关性。认为4.1蛋白家族表达降低参与食管小细胞癌的发生,但不参与其转移过程。

中国人先天性溶血性贫血红细胞膜骨架4.1蛋白电泳变异型(英文)

目的 :鉴定中国人先天性溶血性贫血 (溶贫 )红细胞膜 4.1蛋白 (band4.1)电泳变异类型。 方法 :以普通显微镜、相差镜和扫描电镜观察 2 5例溶贫患者红细胞形态学变化。以 4%～ 15 %梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳作红细胞膜蛋白定性定量分析。结果 :(1) 2 5例红细胞形态学异常溶贫患者中 ,band4.1定性定量改变者 11例 (4 4%)。(2 ) Band4.1电泳变异型 :14.1a/b亚基同时缺陷 ;2 4.1a亚基缺陷 ,a/ b亚基相对含量比值倒置 (患者 0 .6 5～ 1.2 0 ,正常对照 1.87± 0 .2 2 ) ;34 .1a亚基部分缺失伴异常区带 (相对分子质量 70 0 0 0、6 2 0 0 0、480 0 0 ) ;44 .1a亚基完全缺失伴 740 0 0异常区带。 (3)除了 band4.1a完全缺失者为筛孔状红细胞形态变化以外 ,其他电泳变异型与细胞形态学变化无明显对应关系。结论 :Band 4.1缺陷不仅可以导致红细胞椭圆形变和球形变 ,还可导致其他形态改变如筛孔形状。除了 spectrin、band 3以外 ,band 4.1缺陷是中国人遗传性球形红细胞增多症 (HS)另一种常见病因 ,而欧美国家为 ankyrin缺乏 ,在日本更常见 band 4.2缺乏。 Band 4.1a完全缺失和部分缺失伴异常区带电泳型未见于国外文献报道。结果提示 ,HS的主要病因和 band 4.1变异型差异可能与种族不同有关。

蛋白4.1家族在神经系统中的研究进展

蛋白4.1家族是细胞骨架蛋白,包括4.1N、4.1B、4.1G和4.1R四个成员,含有膜结合结构域、血影蛋白-肌动蛋白结合结构域和C端结构域3个高度保守的结构和功能域。蛋白4.1家族在人体包括神经系统等多种组织中表达。对蛋白4.1家族在神经系统Ca2+信号转导、受体通道定位与转运、髓鞘等多种重要结构形成中的重要作用进行综述。近来,蛋白4.1家族发挥抑癌基因作用也引起了广泛关注。

APP转基因小鼠脑组织中4.1B蛋白的表达研究

目的检测4.1B蛋白在阿尔茨海默病模型APP转基因小鼠脑组织中的表达。方法 PCR鉴定APP转基因阳性[APP(+)]小鼠和APP转基因阴性[APP(﹣)]小鼠,分别取不同脑区用免疫组织化学法和免疫印迹法检测4.1B蛋白的表达。结果免疫组织化学法显示在APP(+)鼠和APP(-)鼠的大脑皮层和海马均可见4.1B阳性细胞,APP(+)组小鼠的4.1B蛋白表达明显高于APP(-)组小鼠。免疫印迹法检测APP(+)组和APP(-)组小鼠脑组织海马、皮层和小脑中均有4.1B蛋白的表达,APP(+)组各脑区4.1B蛋白表达均明显高于APP(-)组。结论 APP高表达引起脑组织内4.1B蛋白的表达增高。

胃癌组织中细胞骨架4.1蛋白家族的表达意义

目的:研究细胞骨架4.1蛋白家族成员(4.1B、4.1R、4.1G和4.1N)在胃癌组织中的表达及意义.方法:应用Envision^+免疫组织化学的方法检测104例胃癌(男77例、女27例,中位年龄61.7岁,每例均有详细的临床资料和手术记录.所有病例术前均未进行放疗、化疗)中4.1蛋白家族成员的表达情况.结果:在胃癌组织中,4.1B,4.1R,4.1G和4.1N的表达程度和其在癌旁对照组织中的表达程度均有明显差异(P<0.01),4.1B,4.1G和4.1N的表达程度随着胃癌组织的分化程度降低而减弱,与癌组织分化程度显著相关(P<0.05,P_G<0.01,P_N<0.01),在有淋巴结转移的胃癌中,4.1B,4.1N的表达程度明显低于无淋巴结转移者(P_B<0.05,P_N<0.01).由于仅浸润黏膜层的病例过少,4.1蛋白家族成员的表达与浸润均无相关性(P>0.05).结论:4.1B,4.1G和4.1N参与胃癌的分化调节,4.1B和4.1N则在胃癌的淋巴结转移过程中发挥作用.

细胞骨架4.1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义

背景与目的:4.1蛋白是细胞膜骨架的一个基本成分,参与维持红细胞形状和机械特性。近来研究表明4.1蛋白可能与多种恶性肿瘤的发生有关。本研究旨在探讨细胞骨架4.1家族蛋白成员(4.1B、4.1R、4.1N、4.1G)在非小细胞肺癌组织中的表达和意义。方法:采用EnVision和免疫组织化学法检测147例非小细胞肺癌组织中4.1B、4.1R、4.1N、4.1G蛋白的表达,用Wilcoxon秩和检验及Spearman等级相关检验分析4.1蛋白与肺癌病理特征之间的相关性。结果:与癌旁组织相比,肺鳞癌组织中4.1B、4.1R、4.1N蛋白的表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01);与癌旁组织相比,肺腺癌组织中4.1B、4.1R、4.1N、4.1G蛋白的表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.1B、4.1G在鳞癌组织的表达均显著低于腺癌组织(P<0.05),而4.1R、4.1N在鳞癌组织和腺癌组织的表达差异没有统计学意义(P>0.05)。鳞癌组织中,4.1G的表达与分化程度成显著正相关(rs=0.386,P<0.01);腺癌组织中4.1B、4.1N、4.1G的表达与肿瘤分化程度呈显著正相关(rs=0.276,P<0.05;rs=0.248,P<0.05;rs=0.268,P<0.05)。肺鳞癌及肺腺癌中,4.1B、4.1R、4.1N、4.1G的表达与淋巴结转移与否、肿瘤大小、年龄和性别均无相关性(P>0.05)。结论:4.1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达明显低于癌旁组织,4.1B、4.1N、4.1G的表达与非小细胞肺癌的分化程度有关。

4.1B蛋白的抑制肿瘤作用

4.1R和Merlin是4.1蛋白超家族中两个功能比较清楚的成员,前者通过结合肌动蛋白和血影蛋白维持红细胞骨架结构的完整性;后者为抑癌蛋白,其缺失与脑膜瘤发生有关。4.1B蛋白是4.1R和Merlin的同源蛋白,与二者的结构和功能具有相似性。4.1B蛋白由三个保守的结构域构成,即FERM、SABD和CTD,通过这三个结构域,能与一系列蛋白质相互作用。4.1B蛋白表达缺失与脑膜瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌的发生相关,而过量表达则可激活JNK信号途径,促进细胞凋亡;此外,4.1B蛋白还具有抑制肿瘤转移的功能。因此,目前多认为4.1B基因可能是一个抑癌基因。

心力衰竭小鼠心肌组织中4.1R蛋白的表达

目的:探讨心力衰竭(心衰)小鼠心肌组织中4.1R蛋白的表达及其与心功能的关系。方法:42只雄性健康小鼠随机分为心衰组(n=22)和对照组(n=20)。处死小鼠后迅速取出心肌组织,行HE染色,计算左室质量指数和心肌病理积分;并采用免疫组化染色及免疫荧光标记法检测心衰小鼠心肌组织4.1R蛋白的表达。结果:与对照组比较,心衰组左室质量指数和心肌病理积分升高(t=190.668,Z=31.915,P均<0.05);心衰组心肌组织4.1R蛋白阳性细胞百分比高于对照组(t=18.607,P=0.001)。Pearson直线相关分析显示,心衰组心肌组织4.1R蛋白阳性细胞百分比与左室质量指数呈正相关(r=0.766,P<0.001)。结论:心衰小鼠心肌组织中4.1R蛋白的表达增加,干预4.1R蛋白的表达可能对心衰的治疗及预后有一定的意义。

4.1蛋白家族在大鼠大脑皮质神经细胞中的表达和定位

背景:研究发现不同组织和细胞表达的4.1蛋白种类和剪切形式差别很大,不同4.1蛋白的不同结构域和细胞定位与其功能有必然的联系。目的:观察4.1蛋白家族中4.1R,4.1N,4.1G和4.1B在大鼠大脑皮质神经细胞中的mRNA和蛋白表达和细胞定位。方法:用RT-PCR,Western blot和免疫细胞化学染色及激光扫描共聚焦显微镜技术检测4.1蛋白家族在新生SD大鼠大脑皮质神经细胞中的mRNA和蛋白表达和在细胞中的定位。从细胞水平分析4.1蛋白家族中4.1R,4.1N,4.1G和4.1B的细胞内表达和定位的差异。结果与结论:4.1蛋白家族mRNA和蛋白在大鼠大脑皮质神经细胞均有所表达。4.1R主要表达在神经细胞胞膜和胞浆中,特别是突起延伸或轴突延伸部位高表达。4.1G主要表达在神经细胞的胞浆中,尤其是突起部位。4.1N主要表达在突起胞浆和胞膜。4.1B主要表达在胞体部位的胞浆和胞膜中。结果提示,4.1R,4.1G,4.1N和4.1B蛋白在体外培养的皮质神经细胞中均有不同程度的表达,并且在细胞内定位不同。

细胞膜蛋白与细胞骨架蛋白相互作用研究进展

细胞膜蛋白与胞浆骨架蛋白的相互作用对于维持细胞正常形态 ,细胞粘附与信号传导有重要作用。含有 4 .1 JEF结构域的蛋白 4 .1超家族与含有PDZ结构域的MAGUK蛋白家族能结合多种膜蛋白胞内区与胞浆蛋白 ,在膜蛋白与胞浆蛋白之间建立联系 ,对于细胞、细胞

细胞骨架4．1蛋白基因家族在结直肠癌组织中的表达

目的:探讨4.1蛋白基因家族(蛋白4.1R,N,G和B)在结直肠癌组织表达的意义.方法:采用Envision^+免疫组织化学的方法,检测94例结直肠癌组织中蛋白4.1R,N,G和B的表达,分析他们与结直肠癌病理特征之间的相关性.结果:结直肠癌组织中,除蛋白4.1G外,蛋白4.1R,N,B在癌组织与癌旁组织之间的表达差异有统计学意义(H_c=44.70,H_c=31.4l,H_c =13.62;均P<0.01);蛋白4.1N和B与患者的细胞分化呈正相关(r_s=0.27,r_s=0.28,均P<0.01);随浸润程度的加深,淋巴结的癌转移,4.1R的表达明显下调(r_s=0.03,P<0.01;r_s=0.24,P<0.05);随浸润程度的加深,4.1G的表达上调(r_s=0.24,P<0.05);4.1蛋白的表达与患者的年龄之间没有相关性,在不同性别之间,4.1蛋白表达的差异没有统计学意义.结论:蛋白4.1家族与结直肠的发生与发展间有着密切的关系,是一类新的结直肠癌标记物,其表达程度对结直肠癌的诊断和预后评价有一定的意义.