钙结合蛋白d28k基因在鸡子宫中表达变化的研究

[目的]研究鸡子宫中钙结合蛋白d28k基因的变化规律。[方法]采集不同产蛋阶段蛋鸡的子宫组织,利用RT-PCR方法检测钙结合蛋白d28k mRNA在子宫的表达情况。[结果]蛋进入子宫前2、1 h检测到钙结合蛋白d28k的表达,随着蛋壳的形成和钙化程度的加速,蛋进入子宫后5、15 h钙结合蛋白d28k的表达量逐渐增加,在蛋进入子宫后15 h达到最高水平,在产蛋后1、2 h没有检测到该基因的表达。[结论]钙结合蛋白d28k是影响蛋壳钙化的重要基因。

老年大鼠耳蜗核中钙结合蛋白D28k的表达

建立D-半乳糖衰老大鼠模型获取老年大鼠耳蜗核标本并以正常青年大鼠作对照,用免疫组化SP法检测老年大鼠和青年大鼠耳蜗核中钙结合蛋白D28k的表达。结果显示,老年大鼠耳蜗核钙结合蛋白D28k的积分光密度明显大于对照组(P<0.01)。认为老年大鼠耳蜗核钙结合蛋白D28k含量升高。

维生素D依赖型钙结合蛋白D28k及MC6蛋白异常与C型尼曼-皮克病小鼠神经元骨架病理改变

目的探讨C型尼曼-皮克病(NPC)小鼠模型神经元病变时,维生素D依赖型钙结合蛋白D28k(calbindin D28k)和MC6蛋白异常表达与神经元细胞骨架病变之间的相关性.方法利用免疫组化、免疫荧光标记以及免疫印迹等方法检测NPC1小鼠和野生型对照组小鼠(各8只)脑组织不同部位神经元变性过程中calbindin D28k及MC6蛋白表达,细胞骨架蛋白抗有丝分裂活化蛋白激酶-2 (MAP2)和神经丝(neurofilament,NF)的病理变化.结果 NPC1小鼠4周龄时,calbindin D28k表达为0.68±0.32,稍微高于野生型小鼠(0.53±0.20,P＝0.665),以后5～8周龄的连续变化0.71±0.33, 1.22±0.73均低于对照组的1.20±0.47和 2.28±1.42(P＝0.34,0.045).NPC1鼠小脑浦肯野神经元发生变性早期,calbindin D28k 蛋白表达增高,晚期表达降低.小脑白质、脑干、基底节和部分大脑中出现异常calbindin D28k蛋白颗粒和MC6蛋白.异常的MC6蛋白与calbindin D28k高度共表达.相同部位的神经元NF也明显病理改变.浦肯野神经元则没有发现MC6以及MAP2、NF病理改变.结论 calbindin D28k在NPC1小鼠神经元变性早期可能有短暂的神经元保护作用.随着病程发展calbindin D28k表达异常,并与MC6蛋白密切相关.两者均与神经元细胞骨架结构破坏明显相关.浦肯野细胞变性与MC6和MAP2、NF关系不大.由此推测calbindin D28k参与NPC1小鼠模型神经元细胞骨架病变机制;同时,浦肯野神经元变性、死亡的途径与其他的神经元可能不同.

鸡D28k钙结合蛋白cDNA的克隆与序列分析

根据已发表的鸡D28k钙结合蛋白(CaBP-D28k)基因序列设计合成1对引物,利用RT-PCR技术从新扬州鸡小肠组织RNA中扩增出鸡CaBP-D28kcDNA,并克隆至pGEM-T中,经PCR、Xho 和BamH 双酶切鉴定测序后,用DNAStar软件对克隆出的cDNA进行同源性分析。结果表明:新扬州鸡CaBP-D28k基因片断长为18.5kb,与Gen-Bank中的CaBP-D28k基因具有高度的同源性(99.2%),在开发阅读框内仅有一个碱基的差别,中间没有出现缺失和插入,证明所得到的是鸡CaBP-D28kcDNA。

PTD-Calbindin D28K融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定

目的 构建融合蛋白PTD CalbindinD2 8K(CaBP2 8)的表达质粒 ,并进行诱导表达、纯化 ,在体外初步鉴定其跨膜转运功能。方法 提取大鼠脑组织总RNA ,反转录后用聚合酶链反应 (PCR)法扩增编码CaBP2 8的全长cD NA序列 ,重组入 pET 32a及含有PTD的pTransVector表达载体中 ,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3) ,构建重组体的表达菌株。IPTG诱导表达后 ,以NTA Ni亲和层析柱进行分离纯化 ,SDS PAGE以及Westernblot鉴定。纯化的CaBP2 8及PTD CaBP2 8用FITC标记 ,分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞 ,最后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况 ,并用流式细胞仪 (FCM)做定量分析。结果 成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP2 8表达载体 ,插入片断 783bp ,表达产物相对分子质量分别约 30 0 0 0、5 0 0 0 0 ,经Weternblot鉴定 ,与抗CaBPD2 8K抗体均有特异性反应。孵育培养的cos7细胞后 ,CaBP2 8 FITC仅少量吸附于细胞膜表面 ,而PTD CaBP2 8 FITC则分布于胞质内 ;FCM定量分析发现 ,细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加 ,并且孵育时间为 1h时荧光达到最强。结论 重组PTD CaBP2

D28k钙结合蛋白cDNA的克隆及序列分析

利用RT PCR技术从鸡小肠组织RNA中扩增鸡D2 8k钙结合蛋白cDNA ,以进一步研究D2 8k钙结合蛋白促进肠钙吸收的机理。结果表明 ,鸡肠道D2 8k钙结合蛋白cDNA的开放阅读框由 789个碱基对组成 ,编码由 2 6 2个氨基酸组成的多肽 ,分子质量约为 2 7.9ku ;禽类D2 8k钙结合蛋白基因长 18.5kb ,10个间插序列将其分成 11个编码外显子 ,启动子区以GC为主 (6 0 %～80 % )。D2 8k钙结合蛋白氨基酸序列的同源性在鼠和人之间达到 98.5 % ,在蟾蜍和鸡之间达到80 .9% ,在人和鸡之间为 79.8% ,在鼠和鸡之间为 79.5 %。不同种属的动物之间D2 8k钙结合蛋白的氨基酸序列存在较高的同源性。

乙醇诱导大鼠脑损伤时小脑维生素D依赖性钙结合蛋白28K表达及山莨菪碱的影响

目的探讨乙醇诱导大鼠脑损伤时小脑维生素D依赖性钙结合蛋白28K(CaBP)表达及山莨菪碱的保护作用。方法2月龄SD雄性大鼠分别腹腔注射生理盐水、乙醇、山莨菪碱+生理盐水、山莨菪碱+乙醇(均n=18),8d后行Morris水迷宫测试,免疫组化结合图像分析系统计数小脑CaBP阳性表达的蒲肯野细胞平均面积百分比和灰度值。结果乙醇组Morris水迷宫潜伏期较其他3组延长(P<0.05),游泳距离较生理盐水组和山莨菪碱+生理盐水组延长(P<0.05),与山莨菪碱+乙醇组有延长的趋势,但无显著性差异(P>0.05)。乙醇组小脑CaBP阳性表达的蒲肯野细胞计数、平均阳性细胞面积百分比和灰度值均少于其他3组(P<0.05),山莨菪碱+乙醇组阳性细胞数与生理盐水组和山莨菪碱+生理盐水组无显著性差异(P>0.05),但平均阳性细胞面积百分比和灰度值降低(P<0.05)。结论乙醇可使小脑蒲肯野细胞的CaBP的表达减少;山莨菪碱对此具有一定保护作用。

Calbindin-D28k mRNA在帕金森病小鼠脑内的表达变化

目的 探讨钙结合蛋白D28k(CaBP)在帕金森病(PD)发病机制中的作用。方法 将1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)按30mg/kg体重腹腔注射给C57BL小鼠,建立PD鼠模型。用反转录PCR及原位分子杂交方法检测PD鼠和正常鼠脑内CaBP mRMA的表达变化。结果 与正常鼠对比,CaBP mRNA在PD鼠的海马、纹状体、黑质等脑区的表达水平明显下调。结论 CaBP可能通过对特定脑区神经元的保护作用来抵御PD的发生。

小鼠Calbindin-D28k基因体外表达及其抗凋亡作用的研究

目的:研究钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP)体外表达及其对神经元细胞抗凋亡作用。方法:RT-PCR从小鼠脑组织中扩增出小鼠CaBP的cDNA片段;重组构建pTH-CB质(pcDNA3-TH-CB),脂质体包裹pTH-CB质粒转染MN-9D细胞(多巴胺能杂交瘤神经元细胞);RT-PCR、免疫沉淀法检测CaBP的cDNA在细胞内表达情况;Hoechst染色、Caspase-3活性检测、AnnexinV/PI法对CaBP过表达的抗凋亡作用进行检测。结果:小鼠脑组织RT-PCR扩增出785bp条带,测序结果与Genebank中报道完全一致。脂质体包裹重组构建pTH-CB质粒转染MN-9D细胞后,转染pTH-CB质粒的MN-9D细胞中,CaBP的mRNA表达量和CaBP水平显著高于转染pc-DAN3组和正常MN-9D细胞组(P<0.05),3种细胞凋亡检测方法结果显示,CaBP过表达的细胞抗凋亡能力显著提高。结论:体外克隆CaBP的cDNA能在细胞内表达,过表达的CaBP通过抑制细胞的caspase-3活性,起抗凋亡作用。

甲状旁腺素和活性维生素D在调节肾脏钙结合蛋白中的协同作用

目的:明确甲状旁腺素(PTH)和1,25-二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]在调节肾脏钙结合蛋白中的各自和协同作用。方法:采用免疫组织化学方法观察PTH基因敲除、1α羟化酶基因敲除及双基因敲除对钙结合蛋白D28K和D9K在小鼠肾脏不同部位表达的影响。结果:钙结合蛋白D28K和D9K均定位于肾脏皮质远曲小管及髓质集合管上皮细胞的胞浆内。两种钙结合蛋白在PTH基因敲除小鼠肾脏的表达均明显减少。它们的减少在1α羟化酶基因敲除小鼠更为明显,而以双基因敲除小鼠最为显著。结论:PTH和活性维生素D均能调节钙结合蛋白在肾脏的表达,而且两者具有协同作用。

GDNF对大鼠多巴胺能神经元CB表达的影响

目的研究胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对损伤的多巴胺(dopamine,DA)能神经元的保护作用和神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)在这一保护过程中的影响。方法以培养的新生大鼠中脑脑片损伤模型和在体帕金森病(Parkinson disease,PD)模型作为观察对象。实验分3组:对照组(在无血清培养基内加入PBS或在体黑质内注射PBS)、GDNF组(在无血清培养基内加入GDNF或在体黑质内注射GDNF)、NCAM阻断组(在无血清培养基内于加入GDNF30 min前加anti-NCAM或在体黑质内注射GDNF 30 min前注射anti-NCAM阻断NCAM)。采用免疫组织化学染色技术和Western blot技术,观察各组钙结合蛋白D28K(calbindin D28K,CB)表达的变化。结果GDNF组黑质中CB阳性神经元数目及表达的量明显多于对照组,差别有统计学意义。NCAM阻断组上述指标与GDNF组相比无显著性差异。结论GDNF可能通过增加CB的表达而保护受损的DA能神经元,但NCAM可能未参与这一作用。

胶质细胞系源性神经营养因子保护帕金森模型大鼠黑质多巴胺能神经元机制的研究

目的探讨胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在保护黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元过程中,钙结合蛋白D28K(calbindin 28K,CB)和星形胶质细胞的可能作用。方法采用大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备帕金森病(Parkinson disease,PD)模型。注射后第7天,根据行为学分析筛选模型鼠,将模型鼠随机分为3组:空白对照组,PBS组(右侧黑质注射PBS)和GDNF组(右侧黑质注射GDNF)。空白对照组动物分别于6-OHDA注射后第7天1、4天2、1天和28天时,PBS组和GDNF组动物分别于6-OHDA注射后第14天、21天和28天时,行黑质节段连续冠状石蜡切片,以酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)、CB和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrous acid protein,GFAP)免疫组织化学染色,分别显示DA能神经元、含CB神经元和星形胶质细胞,光镜观察以及细胞计数,统计学处理。结果①TH免疫组织化学染色结果:6-OHDA注射后第28天,GDNF组大鼠右侧黑质TH表达阳性神经元数量显著多于空白对照组和PBS组;②CB免疫组织化学染色结果:6-OHDA注射后第7天,空白对照组大鼠右侧黑质尚可观察到CB表达阳性神经元,之后的时间点空白对照组和PBS组均观察不到,而GDNF组大鼠右册黑质处在所检测的各时间点均可观察到CB表达阳性神经元;③GFAP免疫组织化学染色结果:空白对照组在6-OHDA注射后第7天时有少量的GFAP表达阳性细胞,于注射后第14天时GFAP表达阳性细胞数达高峰,之后逐渐减少,注射后第28天时已基本检测不到;PBS组GFAP表达阳性细胞数量与空白对照组的表现一致,而GDNF组大鼠黑质在所检测的各时间点均可观察到大量反应性增生的星形胶质细胞。结论CB和(或)星形胶质细胞可能参与GDNF保护并促进PD模型大鼠黑质DA能神经元存活的过程。

浅低温联合硫酸镁治疗对全脑缺血大鼠的脑保护作用研究

目的:探讨浅低温联合硫酸镁治疗对大鼠全脑缺血再灌注后的神经保护作用及其与钙结合蛋白表达的关 系。方法:30只SD大鼠随机分为四组:浅低温组(8只),硫酸镁组(8只),浅低温联合硫酸镁组(8只),对照组(6只)。 采用窒息+艾司洛尔(超短效β受体阻滞剂)的心肺骤停模型使大鼠出现全脑缺血。7d后大鼠处死、取脑、切片,免疫组 化分析钙结合蛋白D28k(CB)的活性表达情况,透射电镜下观察脑组织损伤情况,组间数据比较使用t检验和非参数 Kruskal-Wallis检验。结果:浅低温联合硫酸镁组神经元中钙结合蛋白表达程度明显高于对照组(P<0．01),也好于其 它2个单独治疗组(P<0．05),电镜下观察其海马区神经组织损伤程度也较轻。结论:浅低温联合硫酸镁治疗可以减轻 脑缺血再灌注损伤,并好于浅低温或硫酸镁单独治疗,机制可能与促进钙结合蛋白表达有关。

神经细胞黏附分子在胶质细胞系源性神经营养因子保护多巴胺能神经元中的作用

目的研究神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)在胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)保护1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)损伤的多巴胺(dopamine,DA)能神经元中的作用。方法以原代培养的小鼠腹侧中脑神经细胞作为观察对象,实验分4组:空白对照组、MPTP组(在无血清培养基内加入10μmol/LMPTP)、GDNF+MPTP组(在无血清培养基内加入GDNF保护的基础上,再加入MPTP)、抗-NCAM+GDNF+MPTP组(在无血清培养基内加入NCAM封闭抗体阻断GDNF保护作用的基础上,再加入MPTP)。采用免疫细胞化学染色技术,观察各组酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、钙结合蛋白D28K(calbindin D28K,CB)表达的变化。结果MPTP组TH阳性神经元胞体明显小于空白对照组;CB阳性神经元数目减少,有统计学意义。GDNF+MPTP组TH阳性神经元胞体与MPTP组有明显差别;CB阳性神经元数目与MPTP组有显著性差异。抗-NCAM+GDNF+MPTP组上述指标与MPTP组无显著性差异。结论NCAM参与了GDNF保护DA能神经元的作用,该保护作用可能是通过增加CB的表达而完成的。