结肠癌组织微小RNA-3607-3p、细胞周期蛋白E2表达及其与患者术后5年预后关系研究

目的:探讨结肠癌组织微小RNA-3607-3p(miR-3607-3p)、细胞周期蛋白E2(CCNE2)表达及其与患者术后5年预后的关系。方法:选取行结肠癌根治术治疗的88例结肠癌患者癌组织和癌旁组织。RT-qPCR法测定组织miR-3607-3p、CCNE2 mRNA表达。免疫组化法检测组织CCNE2蛋白表达。随访术后5年内结肠癌患者生存情况,根据生存情况将患者分为生存组(48例)和病死组(40例)。分析miR-3607-3p、CCNE2 mRNA与TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移的相关性。Cox回归分析结肠癌患者术后5年预后的影响因素。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-3607-3p、CCNE2 mRNA对患者术后5年内生存的预测价值。结果:结肠癌组织miR-3607-3p表达水平低于癌旁组织,CCNE2 mRNA表达水平和CCNE2蛋白阳性表达率高于癌旁组织(均P<0.05)。miR-3607-3p低表达和CCNE2 mRNA高表达患者TNM分期Ⅲ期、肿瘤低分化、有淋巴结转移的占比更高(均P<0.05)。结肠癌组织miR-3607-3p与CCNE2 mRNA、TNM分期、淋巴结转移呈负相关,与肿瘤分化程度呈正相关(均P<0.05)。CCNE2 mRNA与TNM分期、淋巴结转移呈正相关,与肿瘤分化程度呈负相关(均P<0.05)。miR-3607-3p高表达、CCNE2 mRNA低表达患者5年总生存率高于miR-3607-3p低表达、CCNE2 mRNA高表达患者(均P<0.05)。病死组TNM分期Ⅲ期、肿瘤低分化、有淋巴结转移的患者占比更高(均P<0.05)。病死组结肠癌组织CCNE2 mRNA和蛋白阳性表达率高于生存组,miR-3607-3p低于生存组(均P<0.05)。TNM分期Ⅲ期、肿瘤低分化、有淋巴结转移、miR-3607-3p低表达、CCNE2 mRNA高表达、CCNE2蛋白阳性表达是影响结肠癌患者术后5年生存的独立危险因素(均P<0.05)。结肠癌组织miR-3607-3p、CCNE2 mRNA两者联合预测患者术后5年内生存的曲线下面积(AUC)高于miR-3607-3p、CCNE2 mRNA单独预测的AUC(均P<0.05)。结论:结肠癌组织miR-3607-3p呈低表达,CCNE2呈高表达,两者与患者术后5年预后有关,有望成为结肠癌患者术后5年内生存的预测指标。

基于重组牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2的间接ELISA检测方法建立

为建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的间接ELISA方法,本试验将纯化后的重组BVDVE2蛋白作为抗原包被96孔酶标板,采用方阵滴定法优化间接ELISA的各项反应参数初步建立检测方法,并进一步分析了该方法的特异性、敏感性和重复性。确定的最佳ELISA反应条件如下:抗原包被浓度为1.5μg/mL,1:100稀释待检血清于37℃孵育1 h,1:6 000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG于37℃作用1 h,确定阴、阳性血清临界OD450 nm值分别为0.203和0.226。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与商品化试剂盒的检测符合率达96%,该方法可以用于BVDV抗体的检测和试剂盒的进一步研制。

1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其结构蛋白E2序列分析

为了解河北省唐山市规模化奶牛场中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行毒株的基因特征,本试验于唐山市2个规模化奶牛场采集了49份临床样品进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,并对阳性样品进行病毒的分离,最终成功分离到1株非致细胞病变的BVDV毒株,命名为HB-1株。电镜观察结果显示,HB-1株具有典型的BVDV病毒粒子形态。对HB-1株全基因组序列进行扩增和测序,基因遗传进化分析结果显示,HB-1株属于BVDV-1m亚型。HB-1株结构蛋白E2全长序列糖基化位点和抗原表位预测结果显示,HB-1株E2蛋白含有4个保守的糖基化位点,其中抗原表位1高度保守。本试验为河北省进一步开展牛病毒性腹泻(BVD)流行病学调查、疫苗株筛选以及检测方法建立提供数据支撑。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的:制备抗丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2(E2)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-IdscFv),为研制HCVE2的抗-IdscFv疫苗奠定基础.方法:采用噬菌体表面展示技术,将抗HCVE2单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选出53个克隆,利用酶联免疫黏附法、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCVE2单克隆抗体结合活性较强的抗独特型抗体单链可变区片段(抗-IdscFv)的阳性克隆,并对HCVE2特异性抗-IdscFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了12倍.用酶联免疫黏附实验(ELISA)方法测定第五轮筛选后上清液中含有的抗-IdscFv与HCVE2单克隆抗体结合活性.其中有18株克隆ELISA的吸光度(A450nm)值较高(E11A450nm0.928,E14A450nm1.152,E17A450nm1.136,E28A450nm1.163,E53A450nm0.965).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有5株交叉反应较弱(E11A450nm0.044,E14A450nm0.062,E17A450nm0.166,E28A450nm0.012,E53A450nm0.069),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株(E28)阳性克隆.提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768bp.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得单抗HCVE2的抗-IdscFv,本实验结果为开展用抗-IdscFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.

细胞周期蛋白E2基因mRNA在胃癌组织中的表达

目的了解细胞周期蛋白E2(Cyclin E2)基因mRNA在胃癌组织中的表达情况及Cyclin E2与临床肿瘤病理的关系,探讨Cyclin E2在胃癌发生、发展、侵袭与转移中的作用。方法收集40例手术切除并经病理检查证实的胃癌组织标本,用于RNA提取。按Lauren方案分为肠型胃癌11例,弥漫型胃癌29例;按有无胃周围淋巴结转移分为转移组28例,非转移组12例。临床分期采用UICC的TNM方案,Ⅰ、Ⅱ期13例,Ⅲ、Ⅳ期27例。用RT-PCR法检测胃癌组织Cyclin E2基因mRNA表达。结果肿瘤组织表达Cyclin E2 mRNA均明显高于正常对照组织(P<0.05)。在肿瘤组织中可见Cyclin E2 mRNA在有淋巴结转移的肿瘤组织表达明显高于非淋巴结转移的肿瘤组织(P<0.01),TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期者Cyclin E2 mRNA表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期者(P<0.05)。肿瘤组织中Cyclin E2 mRNA表达与性别及Lauren分型无关(P>0.05)。结论Cyclin E2基因可能促使胃癌转移,其表达水平可能有助于临床分期。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的HCV结构蛋白E2为固相包被抗原 ,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得抗原特异性和结合活性较强的HCVE2人源单链可变区抗体 (ScFv)片段 ,片段为 771bp,阳性克隆 ,对其进行免疫学检测 ,并对HCVE2特异性ScFv的编码基因序列进行测定分析。结果筛选得到的HCVE2ScFv片段 (771bp)

风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2的遗传与变异分析

为了探讨风疹病毒(rubellavirus,RV)包膜糖蛋白E2的基因与蛋白的遗传与变异特点,利用DNAstar软件比较JR23株与GenBank中各参考株E2的基因与多肽序列,分析不同RV株E2基因之间的同源性及E2蛋白功能关键区的氨基酸变异。结果表明,RVE2基因序列比较保守,但JR23株E2基因序列与其它9个分离株之间有明显差异,变异主要集中在484nt～554nt。同源性为90 3%～92 6%之间,与美国疫苗株RA27/3同源性最高,与美国疫苗株HPV77同源性最低,GenBank中的参考株间同源性较高,在96 3%～100 0%之间。E2多肽变异集中于161aa～185aa,但在E2功能关键区,如N端序列、N联糖基化位点、胞质区等则无明显变异。表明RVE2基因序列相对保守,虽然JR23株与GenBank中各参考株的E2基因序列有明显差异,但JR23株E2蛋白在功能关键区表现出遗传稳定性。此结果为阐明RV分子流行病学特征提供了理论依据,也为研究RV分子进化特征及病毒与宿主细胞的相互作用奠定了坚实基础。

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达 ,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因 ,将其插入原核表达载体pET2 8(a)载体中 ,构建pET2 8(a) HCVE2 ,从pET2 8(a) HCVE2上获得His HCVE2融合基因 ,插入pcDNA3 1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3 1 His E2。用脂质体介导法将pcDNA3 1 His E2转染CHO细胞 ,通过间接免疫荧光、Westernblot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内有融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用ＰＣＲ扩增出ＨＧＶＥ２全基因，克隆进杆状病毒表达载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴａ中，构建成重组转座载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＥ２，转化ＤＨ１０ＢＡＣ大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性菌落，抽提大分子质粒ＤＮＡ，获得含ＨＧＶＥ２基因的重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫草地夜蛾Ｓｆ９细胞，出现细胞病变后，收集含有重组病毒颗粒的培养上清，重新感染草地夜蛾Ｓｆ９单层细胞及甜菜夜蛾幼虫，分别收集Ｓｆ９细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞，进行１２％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见表达的融合蛋白带，经亲和层析进行蛋白纯化，用ＥＬＩＳＡ方法检测各类血清标本。

多聚胞嘧啶结合蛋白E2的RNA干扰对白血病32DP210细胞分化影响的分子机制探讨

目的:Bcr/abl诱导多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein-E2,hnRNP-E2]的异常表达在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)急变中起着重要作用。本研究旨在探讨hnRNP-E2特异性小发夹RNA(shor thairpin RNA,shRNA)对小鼠白血病32DP210细胞分化的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:构建能表达特异性抑制小鼠hnRNP-E2基因表达的shRNA(即sh-hnRNP-E2)反转录病毒载体,经Phoenix-Ampho细胞包装后,取上清液感染小鼠白血病32DP210细胞,然后采用RT-PCR和Western印迹法验证sh-hnRNP-E2对hnRNP-E2 mRNA的干扰以及蛋白表达抑制效果,瑞氏染色法观察靶细胞分化情况,FCM法检测粒系分化抗原Gr-1表达情况,Western印迹法检测下游野生型CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα)的表达情况。结果:sh-hnRNP-E2反转录病毒感染32DP210细胞后,显著抑制靶细胞内hnRNP-E2 mRNA和蛋白的表达;靶细胞形态学出现粒系分化特征,细胞表面粒系分化抗原Gr-1表达被诱导;同时,靶细胞内野生型C/EBPα蛋白的表达恢复。结论:sh-hnRNP-E2特异性沉默靶细胞内hnRNP-E2基因表达后,可促进32DP210细胞向粒系分化;其机制可能与hnRNP-E2表达受抑制后,不能再对C/EBPα的翻译模式进行异常调控,从而恢复野生型C/EBPα的表达有关。

HCV包膜蛋白E2的B细胞抗原模拟表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定

目的 采用蛋白质 /多肽递呈技术对HCV包膜蛋白E2进行模拟表位研究。方法 通过使用E2蛋白结合血清中的抗 E2 ,筛选M1 3噬菌体构建的随机肽库 ,寻找E2区蛋白的模拟表位 ;用大肠杆菌硫氧还蛋白作为骨架 ,在其活性部位以“内融合”形式重组表达该模拟表位 ,用HCV感染者血清验证重组蛋白的抗原性。结果 寻找到一个E2区蛋白的模拟表位 ,可能为E2蛋白的构象性表位。结论 本实验为研究HCV外膜蛋白E2抗原表位水平的特异诊断试剂的研制。

牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2基因不同高可变区缺失型核酸疫苗的构建

为了构建牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)囊膜蛋白E2基因高可变区(hyper variable region,HVR)缺失型核酸疫苗,为BVDV防控提供新的方法,试验依据GenBank中BVDV基因组序列设计引物,以BVDV新疆分离株TC cDNA为模板,扩增E2基因并测序,使用生物信息学软件分析E2蛋白的跨膜区和HVR区域等;采用常规PCR和搭桥PCR等方法扩增E2基因的不同缺失型HVR区域,并将其插入到真核表达载体pVAX1中,构建成真核表达质粒;分别于0,2,4周时免疫Balb/c小鼠,并在首次免疫后0,14,28,42天采集血清,通过ELISA法测定IgG水平。结果表明:成功扩增出BVDV TC株E2基因,大小为1122 bp;E2基因与BVDV 1b毒株HP-KY-PK13(登录号KT355592.1)及BVDV 1b毒株3156(登录号JN704144.1)的E2基因具有较高的同源性,E2 HVR1区域位于E2基因N端,HVR2区域位于E2基因中间部位;成功构建了E2基因不同的HVR缺失型真核表达质粒pVAX1-E2 HVR1△1-20、△1-64、△21-40、△41-64和pVAX1-E2 HVR2△140-216;与免疫pVAX1相比,E2基因不同HVR缺失质粒及野生型E2质粒诱导的IgG抗体水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01);而在首次免疫42天时,用pVAX1-E2 HVR1△41-64免疫诱导的IgG抗体水平最高,约为pVAX1-E2的3.9倍。说明用pVAX1-E2 HVR1△41-64制备的核酸疫苗能诱导动物产生较高水平的IgG。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2与CD81关系的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝炎的主要病因之一,其基因组为单股正链RNA,包膜蛋白E2在HCV入侵宿主细胞中起重要作用,CD81可能是HCV的受体或共同受体,进一步研究CD81和HCV E2的相互作用,有助于HCV的治疗和预防。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2与 CD81关系的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝炎的主要病因之一,其基因组为单股正链 RNA,包膜蛋白 E2在 HCV 入侵宿主细胞中起重要作用,CD81可能是HCV 的受体或共同受体,进一步研究 CD81和 HCV E2的相互作用,有助于HCV 的治疗和预防。

茶多酚联合莱菔硫烷对肺癌组织蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2表达的影响

目的探讨茶多酚联合莱菔硫烷对肺癌组织中蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2表达的影响。方法选取经病理证实并手术治疗的肺癌患者56例,随机分为联合给药组和对照组,每组28例。采用ELISA测定所有患者肺组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的含量;免疫组化SP法测定组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的表达并统计微血管密度(microvascular density,MVD);Western Blot检测组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2蛋白表达情况。结果对照组肺癌患者组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的含量均高于联合给药组,差异有统计学意义(P<0.01);免疫组化SP法结果显示肺癌患者癌变组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2的表达均呈阳性表达,且对照组织中MVD高于联合给药组(P<0.01);Western Blot结果显示对照组组织中蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2蛋白表达高于联合给药组(P<0.01)。结论蛋白激酶A锚定蛋白95及细胞周期蛋白E2在肺癌患者组织中均存在表达升高现象,2者表达呈正相关,与药物治疗呈负相关,可以作为肺癌的评估检测指标。

牛乳头瘤病毒蛋白E2／靶DNA结合区结构研究

乳头瘤病毒（ＰＶ）转录的主要调节因子是Ｅ２蛋白。在人乳头瘤病毒中，Ｅ２蛋白调节癌基因Ｅ６和Ｅ７的表达。Ｅ２行使功能的方式是与靶ＤＮＡ的一段由１２个碱基对组成的回文序列（Ｅ２－ＢＳ）发生特异的相互作用。因此，阐明Ｅ２蛋白对靶ＤＮＡ的选择性立体化学机制是研究此类致癌病毒转录调节的关键。牛ＰＶ－１（ＢＰＶ－１）Ｅ２蛋白的靶ＤＮＡ结合区的晶体结构显示出一种新的二聚体形式蛋白／ＤＮＡ结合方式。蛋白质为二聚体β－折叠桶，其外表面为起识别作用的α－螺旋。ＤＮＡ／蛋白界面上分布着复杂交织的氢键网，ＤＮＡ光滑地环绕于Ｅ２β－折叠桶上。

庚型肝炎病毒包膜蛋白E2抗体的研究进展

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV,以下简称HGV)胞膜蛋白E2抗体是新建立的一种实验室检测方法。这种抗体像是一种中和抗体,是HGV既往感染的标志,在清除病毒血症和阻止再感染方面起重要作用,但不是判断有无传染性的标准,也不能用它准确地评价人群中的病毒感染状况。

敲低丝酶抑制蛋白E2(serpin E2)抑制SW480结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移

目的探讨丝酶抑制蛋白E2(serpin E2)对结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法免疫组织化学染色对30名结肠癌患者癌组织和癌旁组织中serpin E2的表达量进行差异性检测,通过转染serpin小干扰RNA(si-serpin)至SW480细胞中,实时定量PCR检测SW480细胞中serpin E2 mRNA水平,Western blot法检测serpin E2蛋白水平,CCK-8法和平板克隆形成实验检测SW480细胞的增殖,TranswellTM实验分别检测SW480细胞的侵袭与迁移能力。结果结肠癌组织中serpin E2表达明显增加,敲低SW480细胞serpin E2水平后,SW480细胞的增殖、侵袭、迁移能力均显著降低。结论下调SW480细胞中serpin E2水平抑制SW480细胞的增殖、侵袭和迁移。

HCV结构蛋白E2在果蝇S2细胞中的稳定表达

目的获得在果蝇S2(S2)细胞中稳定表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(rE2)。方法 PCR扩增截短型E2基因,克隆至pCR2.1-T载体,将测序正确的基因亚克隆至表达载体pMT/Bip/V5-HisC,构建重组表达载体pMT-E2。用FuGENE HD转染试剂将pMT-E2转染至S2细胞,并筛选抗性细胞,然后诱导目的蛋白表达;以Western-blotting法鉴定表达产物与HCV感染者血清反应性。结果成功构建截短型HCV E2表达载体pMT-E2,并获得到稳定表达rE2蛋白的S2细胞株,Western-blotting法证明rE2具有良好的免疫学活性。结论在S2细胞成功表达的HCV rE2蛋白可用于HCV感染者血清的鉴定,为HCV诊断性抗原的优化和重组疫苗的研发提供了实验材料。

细胞周期蛋白E2在人鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的:研究细胞周期蛋白E2(Cyclin E2)在人鼻咽癌(NPC)组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学法和RT-PCR法检测NPC组织及鼻咽非肿瘤组织Cyclin E2蛋白和mRNA的表达。结果:Cyclin E2蛋白在NPC和鼻咽非肿瘤组织中的表达率分别为75%(45/60)和9.5%(2/21),两者相比有统计学意义(P<0.01);鼻咽癌组织中Cyclin E2蛋白的过表达对同年龄、性别的患者无统计学差异(P>0.05),但与淋巴结转移、分期和5年生存率有相关性(P<0.01)。鼻咽癌组与对照组相比,Cyclin E2 mRNA表达亦有统计学差异(P<0.01)。结论:Cyclin E2表达对判断鼻咽癌病变进展、生存率及转移有重要参考价值。