结核分枝杆菌蛋白Rv0309通过蛋白STUB1抑制巨噬细胞自噬对耻垢分枝杆菌胞内存活的影响

目的探讨结核分枝杆菌(MTB)蛋白Rv0309促进耻垢分枝杆菌(Ms)在巨噬细胞胞内存活的分子调节机制。方法以Ms为研究结核分枝杆菌的模型,构建带有对照组pMV261-3*flag空载质粒和实验组pMV261-Rv0309-3*flag质粒的重组Ms并感染RAW264.7细胞。通过计数菌落形成单位(CFU),探索蛋白Rv0309对Ms胞内存活的影响。通过质谱法筛选蛋白Rv0309与宿主相互作用的蛋白,采用免疫共沉淀法(Co-IP)验证宿主蛋白STUB1可与蛋白Rv0309相互作用。敲减RAW264.7细胞STUB1基因后感染Ms,计数CFU,探索STUB1基因敲减后,蛋白Rv0309对Ms胞内存活的影响。敲减RAW264.7细胞STUB1基因后感染Ms,收样后进行Western blot实验,探索STUB1基因敲减后,蛋白Rv0309对巨噬细胞自噬功能的影响。使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析,本实验选择t检验进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果Western blot显示蛋白Rv0309表达于耻垢分枝杆菌体内并分泌到胞外。感染THP-1巨噬细胞实验在24 h时实验组Ms-Rv0309的CFU高于对照组Ms-pMV261,差异有统计学意义(P<0.05)。感染RAW264.7巨噬细胞实验结果趋势与感染THP-1巨噬细胞相同。免疫共沉淀(Co-IP)结果显示免疫沉淀(IP):Flag和IP:HA结果中出现对应的Flag和HA条带。敲减STUB1的实验组(siRNA-STUB1组)CFU水平显著高于未敲减STUB1对照组(NC组)CFU;与对照组Ms-pMV261相比,Ms-Rv0309组CFU均显著高于Ms-pMV261组。实验组Ms-Rv0309的LC3Ⅱ条带在对应时间灰度均浅于对照组Ms-pMV261,8 h时结果最显著(LC3Ⅱ/β-actin:0.76±0.05 vs 0.47±0.07),差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-STUB1组LC3Ⅱ条带在对应时间灰度均浅于NC组;对比Ms-pMV261和Ms-Rv0309菌株感染的CFU结果发现,与Ms-pMV261组相比,在对应时间LC3Ⅱ条带灰度Ms-Rv0309组更浅。结论MTB蛋白Rv0309能够成功表达于耻垢分枝杆菌并分泌到胞外,可抑制巨噬细胞的自噬过程。蛋白Rv0309与宿主蛋白STUB1相互作用,抑制巨噬细胞自噬促进Ms胞内存活。