盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾生理生化及蜕皮相关基因表达的影响

【目的】分析盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾蜕皮生理生化指标、能量代谢酶活性及蜕皮相关基因表达的影响,为实际生产中罗氏沼虾培育提供理论参考。【方法】以300尾平均初始湿体质量4.28±0.53 g/尾的健康罗氏沼虾为对象,试验设0.2‰(对照)、3.0‰、6.0‰、9.0‰、12.0‰等5个盐度梯度,记录不同盐度条件下罗氏沼虾的蜕皮周期、每日蜕皮率和蜕皮增重率。按照不同蜕皮时期取肝胰腺、肌肉和鳃丝,使用生化试剂盒测定丙酮酸激酶(PK)和琥珀酸脱氢酶(SDH)活力,并用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测蜕皮抑制激素(MIH)、维甲酸X受体(RXR)、蜕皮激素受体(EcR)、保幼激素酯酶环氧水解酶(JHEH)基因的表达情况。【结果】罗氏沼虾的蜕皮周期随盐度的升高而不断延长,其中6.0‰盐度组蜕皮周期最长,显著高于0.2‰盐度组(P<0.05);蜕皮增重率随盐度的升高总体呈下降趋势,在盐度6.0‰、9.0‰和12.0‰组中的蜕皮增重率显著低于0.2‰盐度组。在5个盐度条件下,肝胰腺、鳃丝的PK和SDH的活力均在蜕皮后期B有最大值,随着蜕皮后时间的延长,到蜕皮前期D时,其活力呈现下降的趋势,表明肝胰腺、鳃丝组织在蜕皮后期时能量代谢酶活力达到最高水平。在4个蜕皮阶段下,随着盐度的升高,肝胰腺和鳃丝的PK和SDH活力总体呈先上升后下降的趋势。低盐度的刺激导致罗氏沼虾肌肉的PK和SDH活力升高,而在12.0‰盐度组活力下降。MIH基因在各盐度组的相对表达量均随蜕壳时间的延长而明显下降,在0.2‰和3.0‰盐度组蜕皮后期A与蜕皮后期B的相对表达量显著高于蜕皮间期C。RXR基因在蜕皮间期C的相对表达量最高,其他蜕皮时期均极显著低于0.2‰盐度组(P<0.001)。与蜕皮间期C相比,各盐度组JHEH基因均在蜕皮前期D的相对表达量最高,而在3.0‰、6.0‰和12.0‰盐度组时,鳃丝EcR基因的相对表达量在蜕皮前期D极显著高于蜕皮间期C(P<0.001)。【结论】低盐度对罗氏沼虾的生长蜕皮有较大影响,不仅导致蜕皮增重率下降,蜕皮周期变长,对生产实践产生负面影响,还可使罗氏沼虾肌肉和肝胰腺的PK和SDH活力升高,从而促使肝胰腺和肌肉中的糖酵解速率加快,三羧酸循环作用加强,但在高盐度(12.0‰)条件下受到抑制。盐度胁迫下,MIH基因上调表达、EcR基因下调表达会引发蜕皮前期D时间延迟,蜕皮困难,致使JHEH和RXR基因表达下调,是导致罗氏沼虾生长缓慢的主要原因。罗氏沼虾养殖适宜的水体盐度为0.2‰~3.0‰。

罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控和蜕皮信号通路相关基因的表达分析

蜕皮是罗氏沼虾重要的生理过程,为了探究罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控与蜕皮通路中相关基因在蜕皮周期中的表达模式,阐明罗氏沼虾蜕皮的分子调节通路。本研究测定了罗氏沼虾肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮周期内蜕皮相关酶活性(谷氨酰胺合成酶,β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶)与蜕皮激素含量,并通过RT-qPCR分析了蜕皮信号通路中Mr-ETHR、MrFTZ-F1以及RXR、ECR和MIH基因在罗氏沼虾不同蜕皮周期内的表达模式。酶活测定结果表明,谷氨酰胺合成酶在血淋巴组织中活力高于肝胰腺组织(P<0.05);β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶在肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮前期的活力远高于蜕皮后期(P<0.05)。在肝胰腺中几丁质酶在蜕皮后期活力显著高于其他时期(P<0.05)。肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮激素含量在蜕皮间期最低,蜕皮后期达到最高,呈上升趋势。通过PCR扩增与测序验证获得了Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1基因ORF全长序列,Mr-ETHR基因ORF全长1173 bp,编码390个氨基酸;Mr-FTZ-F1基因ORF全长为1206 bp,编码401个氨基酸。荧光定量结果表明Mr-ETHR、MrRXR和Mr-ECR在蜕皮后期表达量达到最高,而Mr-FTZ-F1在蜕皮前期表达量达到最高。Mr-MIH在蜕皮间期表达量达到最高,蜕皮后期表达量最低,呈下降趋势。聚类分析及相关性分析结果表明Mr-ETHR与Mr-RXR和Mr-ECR表达模式相近且呈极显著正相关(r=0.7030,P<0.01;r=0.8680,P<0.01),Mr-FTZ-F1和Mr-MIH表达模式相近且呈极显著正相关(r=0.6665,P<0.01),而MrFTZ-F1与Mr-ECR和Mr-ETHR呈极显著负相关(r=-0.8339,P<0.01;r=-0.6275,P<0.01)。研究表明罗氏沼虾的蜕皮过程受谷氨酰胺合成酶、β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶的调节,Mr-ETHR、Mr-RXR、Mr-ECR、Mr-FTZ-F1和Mr-MIH参与调控罗氏沼虾蜕皮过程,Mr-ETHR、Mr-RXR和Mr-ECR在蜕皮信号通路中起正向调节作用,而Mr-FTZ-F1和Mr-MIH起负调节作用。本研究结果为甲壳动物蜕皮信号通路下游基因的蜕皮调控机制研究提供了基础资料。