妊娠早期蜕膜甲状腺激素受体信号异常对蜕膜化进程的影响及其与流产发生的关联

目的评估自然流产患者蜕膜血管生成情况,并探讨自然流产患者蜕膜中甲状腺激素受体信号的表达改变。方法收集行人流术的孕妇蜕膜。以自然流产患者作为实验组,以社会因素行人流术的健康孕妇作为对照组,收集两组人群蜕膜组织。采用Western blot方法,检测蜕膜组织中甲状腺激素受体-α(THR-α)和THR-β的核转位情况,同时使用免疫组化法定位蜕膜组织中THR-α和THR-β的分布。Western blot测定蜕膜组织中Ⅱ型脱碘酶(DIO2)的蛋白表达水平,免疫荧光法定位DIO2在蜕膜组织分布并测定荧光强度。使用免疫组化,以CD34作为内皮标志物测定蜕膜血管密度。Western blot检测血管内皮生长因子受体(VEGFR-1)的蛋白表达水平。结果对照组与流产组在年龄、妊娠天数、TSH、T3、T4等基本资料中,差异均无统计学意义。Western blot结果提示THR-α和THR-β蛋白核转位置下降,同时蜕膜组织免疫组化染色结果表明自然流产患者蜕膜甲状腺激素受体核转位减少(P<0.05)。Western blot结果表明流产组DIO2蛋白表达较对照组下降,提示自然流产孕妇蜕膜中,甲状腺激素代谢受到影响;免疫荧光实验结果显示流产组DIO2的荧光强度较对照组减弱(P<0.05)。免疫组化法CD34标记蜕膜小血管的结果显示,在流产组中,CD34^(+)血管数量下降,差异有统计学差异(P<0.05)。Western blot结果提示流产组和对照组中VEGFR-1无明显变化,差异无统计学意义。结论蜕膜局部甲状腺激素受体信号异常可能导致蜕膜血管生成减少,从而参与自然流产的发生。

氟苯尼考影响子宫内膜基质细胞蜕膜化的功能研究

目的:探究氟苯尼考(florfenicol,FLO)暴露对蜕膜化的影响及线粒体在其中发挥的作用。方法:构建FLO暴露的原代小鼠蜕膜基质细胞(mouse decidual stromal cells,mDSCs)模型,经FLO(1.56、6.25、25.00μg/mL)暴露后,采用鬼笔环肽染色法观察细胞形态变化,采用Western blot检测蜕膜化标志分子HOXA10表达以分析FLO对蜕膜化的影响;采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用Western blot检测细胞增殖标志分子PCNA表达以分析FLO对蜕膜化过程中细胞增殖、凋亡的影响;采用荧光探针Mito-tracker Red观察线粒体形态,采用免疫荧光检测线粒体外膜标志蛋白TOMM20表达并检测ATP水平以分析FLO对蜕膜基质细胞线粒体功能的影响。结果:25.00μg/mL FLO暴露导致细胞形态异常,蜕膜化标志分子HOXA10表达降低(P=0.002),细胞凋亡水平增加,细胞增殖能力降低;进一步发现FLO暴露后线粒体外膜标志蛋白TOMM20表达降低(P=0.010)、线粒体形态异常和ATP水平降低(P=0.003)。结论:25.00μg/mLFLO暴露可能与线粒体功能打破mDSCs的细胞增殖、凋亡平衡,损伤蜕膜化进程有关。

养血安胎方调节自噬改善复发性自然流产小鼠子宫内膜上皮细胞间质转化及蜕膜化的作用研究

目的探讨养血安胎方调节自噬改善复发性自然流产(RSA)小鼠子宫内膜上皮细胞-间质转化(EMT)及蜕膜化的作用。方法构建肾虚血瘀型RSA小鼠以及正常妊娠小鼠,正常妊娠小鼠分别腹腔注射2 mg·kg^(-1)雷帕霉素(Rapa)溶液或15 mg·kg^(-1)3-甲基腺嘌呤(3-MA)溶液进行干预;另设置相同方法处理的RSA小鼠、Rapa及3-MA干预的小鼠组,并同时灌胃给药浓度为28.08 g·kg^(-1)的养血安胎溶液进行干预,收集小鼠子宫内膜。通过Western blot法测定小鼠子宫内膜EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Fibronectin的表达,以及蜕膜化相关蛋白BMP2、HOXA10、PRL和IGFBP1的表达。结果与正常妊娠组比较,RSA组小鼠子宫内膜中E-cadherin的蛋白表达显著增加,Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、BMP2、HOXA10、PRL和IGFBP1的蛋白表达均显著降低;Rapa组小鼠子宫内膜中E-cadherin的蛋白表达显著增加,Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、BMP2、HOXA10、PRL和IGFBP1的蛋白表达均显著降低;3-MA组小鼠子宫内膜中E-cadherin的蛋白表达显著降低,HOXA10的蛋白表达显著增加。与RSA组比较,RSA+养血安胎组小鼠子宫内膜中E-cadherin的蛋白表达显著降低,Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、BMP2、HOXA10、PRL和IGFBP1的蛋白表达均显著增加。与Rapa组比较,Rapa+养血安胎组小鼠子宫内膜中E-cadherin的蛋白表达显著降低,Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、BMP2、HOXA10、PRL和IGFBP1的蛋白表达均显著增加。结论养血安胎方能够抑制自噬,从而促进妊娠小鼠子宫内膜的EMT及蜕膜化过程,降低流产率。

慢病毒载体介导的类固醇生成因子-1沉默调控子宫内膜基质细胞蜕膜化与自噬

目的探讨慢病毒载体介导的类固醇生成因子-1(SF-1)沉默对人子宫内膜基质细胞(hESCs)蜕膜化进程的影响及机制。方法收集子宫内膜异位症(EM)患者与正常妊娠者的子宫内膜组织,通过Real-time PCR和免疫组织化学染色检测SF-1的差异表达情况。从正常妊娠者的子宫内膜组织中分离并鉴定hESCs,将hESCs分为对照组、雌二醇(E_(2))+孕酮(P4)组、短发夹RNA(shRNA,sh)-正常对照(NC)+E_(2)+P4组、sh-SF-1+E_(2)+P4组,进行对应处理后,倒置显微镜下观察hESCs形态变化,Real-time PCR和Western blotting分别检测细胞内人胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、泌乳素(PRL)的mRNA表达水平和蛋白表达水平,流式细胞术测定细胞周期分布,免疫荧光染色观察细胞内自噬标记物微管相关蛋白轻链3(LC3)表达情况,Western blotting测定细胞内自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1表达水平。结果EM患者子宫内膜组织中SF-1 mRNA相对表达量和SF-1蛋白阳性率均高于正常妊娠者子宫内膜组织(P<0.05)。与sh-NC+E_(2)+P4组比较,sh-SF-1+E_(2)+P4组细胞多为长梭形,未见明显蜕膜化,IGFBP1、PRL的mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例显著减少而S期细胞比例显著增加(P<0.05),细胞内LC3荧光表达增强,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高,Beclin-1蛋白相对表达量也显著上调(P<0.05)。结论EM患者子宫内膜组织内SF-1表达升高,通过慢病毒载体介导的SF-1沉默能够抑制hESCs蜕膜化过程,该作用可能与调控细胞自噬水平相关。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B与子宫内膜蜕膜化关系的研究进展

子宫内膜蜕膜化是决定妊娠能否成功的关键因素之一。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是哺乳动物细胞内基础信号转导通路中的主要细胞因子,在细胞的生长、增殖、凋亡、自噬、血管生成等生理和病理过程中发挥着极其重要的生物学功能。PI3K/蛋白激酶B(PKB/Akt)信号通路在细胞代谢、迁移、分化等方面影响子宫内膜蜕膜化。深入研究PI3K/Akt在子宫内膜蜕膜化中的作用,可为蜕膜化缺陷相关疾病的诊断和治疗提供新思路,对更好地指导临床、提高妊娠成功率具有重要意义。

不明原因复发性流产患者分泌晚期外周血中自噬水平对蜕膜化调控作用及补肾活血方干预机制

目的探索分泌晚期外周血中自噬水平的异常对不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)患者蜕膜化的影响及补肾活血方的作用机制。方法收集至少有过一次成功妊娠且无自然流产史的女性(对照组)40例和肾虚血瘀型URSA患者(观察组)40例。观察组在入组后的3个月内严格按照实验要求服用中药汤剂补肾活血方。运用ELISA法检测两组分泌晚期血清中人胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor-binding protein-1,IGFBP-1)和催乳素(prolactin,PRL)水平,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关基因6(Beclin 1)、泛素样结合蛋白(p62)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达。结果(1)观察组中自噬水平、蜕膜化水平较对照组女性明显降低。(2)治疗后观察组自噬水平、蜕膜化水平较入组时有明显改善。结论(1)URSA患者分泌晚期外周血中自噬水平降低影响蜕膜化水平,进而增加流产发生的风险。(2)补肾活血方可显著改善肾虚血瘀型URSA患者分泌晚期外周血中自噬水平,进而改善蜕膜化状态,为正常妊娠奠定基础。

非编码RNA在调控子宫内膜蜕膜化中的研究进展

蜕膜化是子宫内膜组织为胚胎植入发生的一系列重塑过程,是胚胎植入和发育的必备前提,对正常妊娠的维持也具有重要意义。近年来,关于非编码RNA调控子宫内膜蜕膜化的研究取得了许多重要进展。该文主要对miRNA、lncRNA和circRNA等非编码RNA调控子宫内膜蜕膜化的研究进展进行综述,为深入探讨子宫内膜蜕膜化调控机制,寻找相关疾病的诊疗靶点提供新思路。

非编码RNA调控哺乳动物子宫内膜容受性和蜕膜化的研究进展

子宫内膜容受性和蜕膜化作为胚胎附植的重要环节,影响哺乳动物的成功妊娠和繁殖性能,所以探究子宫生理功能的调控机制对提高母畜繁殖率具有重要意义。子宫内膜容受性是指子宫内膜允许囊胚定位、黏附、侵入并最终着床的能力。为了转变为接受状态,子宫内膜需要经历一系列形态和功能重塑,其中子宫内膜基质细胞会增殖分化为蜕膜细胞,发生蜕膜化过程。非编码RNA(ncRNAs)影响多种生理过程,包括对子宫内膜功能的调节,其中lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA的竞争内源性RNA(ceRNA)网络理论是一种重要的分子调控机制。本文就miRNA、lncRNA和circRNA调控子宫内膜容受性和蜕膜化过程作用机制的研究现状进行综述,以期为深入了解ncRNAs在哺乳动物子宫中的调控作用提供理论指导和新思路。

双酚A通过MLL1调控子宫内膜蜕膜化分子标志物HOXA10表达的分子机制

目的探讨组蛋白甲基化转移酶混合谱系白血病基因(MLL1)在双酚A(Bisphenol,BPA)影响子宫内膜间质细胞蜕膜化中的作用机制。方法CCK-8实验检测10pM、10nM、10μM BPA对细胞增殖能力的影响;RT-PCR和Western Blot检测BPA暴露后蜕膜化子宫内膜间质细胞中的MLL1及同源盒基因A10(HOXA10)mRNA和蛋白表达情况;CoIP实验验证MLL1和雌激素受体α(ERα)是否相互结合,以及BPA是否影响两者的结合;ChIP检测MLL1和ERα在HOXA10启动子区的富集效率。结果三种浓度BPA均不损害细胞的增殖能力;蜕膜化子宫内膜间质细胞中MLL1和HOXA10 mRNA和蛋白表达随着BPA浓度的升高逐渐降低;MLL1是ERα的共同作用因子,BPA暴露影响MLL1与ERα的结合;BPA暴露抑制了MLL1和ERα在HOXA10启动子ERE元件区域的富集。结论BPA通过影响转录因子ERα和共同作用因子MLL1在HOXA10启动子区的富集,调控HOXA10的表达,影响子宫内膜间质细胞蜕膜化。

LncRNA GAS5对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响

为了研究长链非编码RNA生长抑制特异性转录本5(lncRNA GAS5)在小鼠子宫中的表达及其在子宫内膜蜕膜化中的作用,本试验收集妊娠第1~8天的小鼠子宫组织样本,分离妊娠第4天的小鼠子宫内膜基质细胞(ESC)并通过类固醇构建体外诱导蜕膜化模型,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测GAS5、蜕膜化标志因子蜕膜催乳素相关蛋白(Dtprp)、心脏神经脊衍生物表达转录因子2(Hand2)、骨形态发生蛋白2(Bmp2)、肝/肾/骨型碱性磷酸酯酶(Alpl)和同源异形盒基因A10(Hoxa10)的表达水平,采用荧光原位杂交(FISH)技术检测GAS5在ESC中的表达和定位。结果显示,与妊娠第1天相比,在妊娠第4天小鼠子宫组织中GAS5的表达水平显著升高(P<0.05);与妊娠第4天相比,GAS5的表达水平在妊娠第6~8天又随着蜕膜化的进行逐渐下降(P<0.05);与阴性对照(si-NC组)相比,GAS5沉默会引起ESC中蜕膜化相关的基因Dtprp、Hand 2、Bmp 2、Alpl和Hoxa 10表达水平显著增加(P<0.05或P<0.01);GAS5在ESC和蜕膜ESC的细胞质和细胞核中均有表达。结果表明,GAS5参与调节小鼠早期妊娠和蜕膜化进程。

ATF6在转基因敲除鼠人工诱导蜕膜化模型中的研究

目的利用小鼠人工诱导蜕膜化模型,探讨转录活化因子6(ATF6)在小鼠子宫内膜中的作用机制。方法构建繁育野生型(Atf6^(+/+))和ATF6敲除型(Atf6^(-/-))小鼠,并构建小鼠人工诱导蜕膜化模型。雌鼠交配后见阴栓第1天记为Day 1。Day 4进行诱导蜕膜化,蜕膜化后48 h和72 h(即Day 6和Day 7)收集小鼠子宫进行相应指标检测,实时荧光定量PCR方法和蛋白质免疫印迹法检测Atf6 mRNA与蛋白质在蜕膜化子宫中的表达情况;免疫组织化学方法检测野生型(Atf6^(+/+))和ATF6敲除型(Atf6^(-/-))小鼠人工诱导蜕膜化模型中ATF6和催乳素(PRL)在子宫中的阳性信号表达情况。收集人子宫内膜生理周期中不同时相子宫内膜组织,进行石蜡包埋切片,免疫组织化学方法检测ATF6在子宫内膜中的阳性信号表达情况。结果与小鼠未蜕膜子宫相比,Day 6和Day 7蜕膜化子宫中的Atf6 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),细胞核内的蛋白水平也显著增高(P<0.05);Day 7时子宫大体形态学显示子宫较粗且均匀。野生型和敲除鼠诱导蜕膜化子宫HE染色显示,绝大部分子宫基质细胞变大变圆,表明诱导蜕膜化的子宫内膜蜕膜化充分;PRL免疫组化染色结果表明,在野生型(Atf6^(+/+))和敲除型(Atf6^(-/-))小鼠蜕膜化子宫内膜中,PRL染色阳性信号分布范围无显著性差异(P>0.05)。不同月经周期时相人子宫内膜组织的免疫组化结果提示,ATF6在月经期和增殖早期的表达水平较高,显著高于其余周期时相(P<0.05)。结论ATF6能够参与子宫内膜蜕膜化,但不是蜕膜化发生的必要条件;ATF6可能通过参与子宫内膜的生理修复过程参与子宫内膜生理周期。

β-烟酰胺单核苷酸对反复着床失败患者子宫内膜基质细胞蜕膜化水平的影响

目的:探讨在体外受精-胚胎移植反复着床失败患者子宫内膜基质细胞中添加β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)对子宫内膜基质细胞蜕膜化水平的影响。方法:活检获得反复着床失败3例患者子宫内膜组织,酶消化分离体外培养后获得了三株原代子宫内膜基质细胞。根据培养过程中添加β-NMN和诱导蜕膜化情况分为实验组、对照组、空白组。实验组在子宫内膜基质细胞蜕膜化培养过程中添加β-NMN,对照组不添加β-NMN,无蜕膜化培养为空白组。比较3组细胞培养过程中蜕膜标志物泌乳素(PRL)和人胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)的mRNA表达和分泌水平。结果:实验组PRL(2.38±0.10 ng/nl)、IGFBP-1(1.89±0.12 ng/nl)水平均高于对照组(1.19±0.17 ng/nl、0.99±0.20 ng/nl)(P<0.05),对照组与空白组相比无差异;定量PCR检测蜕膜前后细胞内PRL(15.82±12.92)和IGFBP-1(9.86±8.67)的mRNA表达量上升(P<0.05)。结论:反复着床失败患者子宫内膜基质细胞蜕膜化中添加β-NMN能够提高蜕膜化水平。

妊娠过程中子宫内膜蜕膜化机制

经过40余年的发展,人工辅助生殖技术得到了广泛的应用,为数以百万计的家庭带来了福音。然而这些技术仍然存在许多挑战,如相对较低的妊娠成功率及体外受精-胚胎移植技术所生婴儿的健康风险高于自然受孕婴儿等。因此,需要进一步分析相关生理基础和技术程序。接受辅助生殖的女性妊娠失败主要发生在妊娠早期,对胚胎着床和子宫蜕膜化两大关键事件机制的探索就显得尤为重要。人子宫蜕膜化涉及到子宫内膜间质细胞剧烈的形态与功能的分化,对于妊娠成功至关重要。对人类而言,cAMP和孕激素信号是启动子宫蜕膜化的关键。文章总结了近年来蜕膜化中几个重大事件的研究结果,包括蜕膜化的启动、内膜基质细胞的改变、子宫腺分泌的增加及子宫自然杀伤细胞的增多,以期为进一步理解人类子宫蜕膜化内在机制与诸多不育问题及提高人工生殖技术的成功率提供参考。

LncRNA H19促进子宫内膜蜕膜化的作用研究

目的探究LncRNA H19对子宫内膜蜕膜化的作用。方法采用RT-qPCR检测自然流产和人工流产蜕膜组织中的LncRNA H19表达情况;检测非妊娠子宫内膜和不同孕周蜕膜组织中LncRNA H19的表达;使用MPA和8-Br-cAMP诱导剂诱导子宫内膜间质细胞(transformed human endometrial stromal cells,THESCs)使其蜕膜化,RT-qPCR检测蜕膜化标志物催乳素(prolactin,PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1)的表达;检测蜕膜化后LncRNA H19和FOXO1的表达变化;使用慢病毒分别过表达和干扰THESCs中的LncRNA H19,CCK-8检测THESCs的增殖情况。慢病毒转染成功后再诱导蜕膜化,RT-qPCR检测空白对照组、LV-GFP诱导组、LV-H19-RNAi诱导组和LV-H19诱导组的PRL、IGFBP-1和FOXO1的表达。结果自然流产组LncRNA H19表达低于人工流产组(P<0.01);LncRNA H19在孕早期人工流产蜕膜组织第7周达到高峰(P<0.01);THESCs蜕膜化后,PRL、IGFBP-1、LncRNA H19和FOXO1的mRNA表达较对照组增高(P<0.05,P<0.01)。CCK-8结果显示干扰LncRNA H19后THESCs的增殖被抑制(P<0.01),而过表达LncRNA H19后THESCs的增殖被促进(P<0.01)。分别干扰和过表达THESCs的LncRNA H19后再进行蜕膜化诱导,与空白对照组比较,LV-GFP诱导组的PRL(P<0.05)、IGFBP-1(P<0.01)和FOXO1(P<0.01)的mRNA表达升高。与LV-GFP诱导组比较,LV-H19诱导组PRL(P<0.05)和IGFBP-1(P<0.01)的mRNA表达升高,而LV-H19-RNAi诱导组的PRL(P<0.05)、IGFBP-1(P<0.01)和FOXO1(P<0.01)的mRNA表达降低。结论LncRNA H19促进子宫内膜间质细胞增殖和蜕膜化。

小鼠子宫内膜基质细胞分离培养、鉴定及体外蜕膜化的诱导

背景:国内已建立许多有关人的子宫内膜基质细胞分离培养及蜕膜化的诱导方法,但人的子宫标本存在取材困难等问题。目的:建立小鼠子宫内膜基质细胞的分离培养及体外蜕膜化的诱导方法,为进一步研究子宫内膜蜕膜化的机制提供一种简单、有效的模型。方法:通过胰酶与胶原酶Ⅱ消化及差时贴壁等方法,分离和纯化小鼠妊娠第4天的子宫内膜基质细胞;用细胞免疫化学方法鉴定基质细胞;通过孕酮和雌二醇联合处理诱导子宫内膜基质细胞的蜕膜化,然后用苏木精染核、实时定量PCR和免疫印迹方法检测蜕膜化标志分子的变化。结果与结论:①分离培养的子宫内膜基质细胞的存活率为(90.1±2.3)%。②细胞免疫化学方法染色显示,分离纯化的子宫基质细胞Vimentin染色呈阳性,而Cytokeratin染色呈阴性,细胞纯度可达(92.3±2.4)%。③孕酮和雌二醇处理48,72h后,苏木精染色显示细胞呈现多核化,蜕膜化标志分子dPRP、周期蛋白D3、孕酮受体mRNA随着培养时间延长均明显增加(P<0.05)。结果可见采用酶消化和差时贴壁方法,可获得高纯度的子宫内膜基质细胞;子宫内膜基质细胞在体外通过孕酮和雌二醇联合诱导可产生蜕膜化。

母-胎界面免疫细胞交互对话参与蜕膜化的分子机制

妊娠是一个复杂的生理过程,作为同种移植物的胎儿能够在母体内正常发育、生长是一个在细胞与分子水平上受到严密调控的过程。受精卵经输卵管运行到达母体宫腔后,要经过定位、黏附、穿入完成着床过程,着床后的囊胚开始不断地从母体吸取营养。在这一过程中,母体的子宫内膜增殖,内膜新生血管形成,在一系列因素的调控下,母体的子宫内膜发生蜕膜化,这一生理变化对于胚泡正常着床是至关重要的,异常的蜕膜化过程将导致着床失败,

睾酮在子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中的作用

目的:探讨雄激素在生殖调节中所起的作用。方法:采用2×2析因设计,观察睾酮（T）、孕酮（P）对体外培养的子宫内膜间质细胞生长与分化的调节以及激素问的相互影响。结果:睾酮刺激细胞增殖的同时也促进其分化,使细胞密度增大,漩涡状生长,细胞呈小多角形而产生 PRL。而 P+T促使梭形细胞生长,胞体变粗大,细胞分化成蜕膜细胞,PRL分泌明显增加,但蜕膜细胞很快脱落。结论:睾酮在子宫内膜间质细胞的蜕膜化过程中具有3重作用,它不仅能促进子宫内膜间质细胞分化成多角形细胞,同时还刺激其细胞分裂增生,并调节蜕膜细胞的凋亡。推测雄激素在体内与其它激素间的平衡调节对维持正常子宫内膜的生理功能及妊娠具有重要意义。

过氧化氢对蜕膜化小鼠子宫内膜基质细胞的影响

目的植入前的胚胎对氧化应激敏感,低氧状态可能更有利于胚胎的生长及发育。文中旨在探讨过氧化氢(H_2O_2)对蜕膜化小鼠子宫内膜基质细胞(ESCs)的影响,构建蜕膜化小鼠ESCs氧化应激模型。方法采用酶解联合筛网过滤及差时贴壁方法分离培养原代小鼠ESCs。实验分为4组(n=8):空白对照组为含基础培养液的小鼠子宫内膜基质细胞(ESCs);蜕膜化组:基础培养液中加入10 nmol/L E2、1μmol/L P4体外诱导小鼠ESCs蜕膜化72 h;阴性对照组:小鼠ESCs蜕膜化诱导成功后,仅予基础培养液干预4 h;氧化应激组:小鼠ESCs蜕膜化诱导成功后,分别加入含50、100、150、200、250、300μmol/L H_2O_2的基础培养液继续干预4 h。免疫组化法检测Vimentin、Cytokeratin表达鉴定原代小鼠ESCs,RT-PCR检测d PRP mRNA的表达鉴定ESCs蜕膜化,CCK-8法检测H_2O_2干预后细胞生长和增殖活性,流式细胞仪检测细胞内ROS水平判断氧化应激程度。结果成功分离、培养和鉴定原代小鼠ESCs。镜下观察细胞呈梭形和多角形、放射状排列;细胞免疫荧光染色检测结果表明Vimentin表达(+)、Cytokeratin(-),原代小鼠ESCS纯度达(96.3±0.49)%。10 nmol/L E2、1μmol/L P4作用下,蜕膜化组蜕膜化标志物d PRP mRNA显著高于空白对照组(1.0010±0.0011 vs 0.000 2±0.0000,P<0.01)。与阴性对照组抑制率[(1.000±0.000)%]比较,氧化应激组在H_2O_2浓度为50、100、150、200、250、300μmol/L作用下抑制率[(0.013±0.004、0.032±0.007、0.069±0.023、0.172±0.007、0.395±0.018、0.706±0.013)%],其中150、200、250、300μmol/L H_2O_2与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。进一步评估50、100μmol/L H_2O_2干预后测得的细胞内氧化应激组ROS明显高于阴性对照组(27.77±4.20 vs 17.47±0.61,43.57±6.58 vs 17.47±0.61,P=0.001)。结论 50、100μmol/L H_2O_2不影响蜕膜化小鼠ESCs的生长、增殖,且随H_2O_2浓度增加,刺激细胞内ROS的产生增多,100μmol/L H_2O_2可作为蜕膜化小鼠ESCs氧化应激模型建立的合适刺激浓度。

小鼠子宫内膜诱导蜕膜化的研究

[目的]建立体内和体外诱导小鼠子宫内膜蜕膜化的方法。[方法]利用假孕小鼠子宫角注油和激素处理体外分离的4周龄小鼠子宫内膜基质细胞进行诱导蜕膜化,通过半定量PCR和实时定量PCR检测蜕膜化标志分子蜕膜/滋养层泌乳雌激素相关蛋白。[结果]假孕第4天子宫角注油和雌激素与孕酮联合处理小鼠子宫内膜基质细胞都可显著提高蜕膜化标志分子的mRNA水平,可诱导产生蜕膜化。[结论]建立了体内和体外诱导蜕膜化的方法,为验证小鼠蜕膜化芯片奠定了基础。

Nur77促进人子宫内膜蜕膜化间质细胞中催乳素的表达

目的蜕膜化催乳素在妊娠的建立与维持中具有重要作用,但目前对参与蜕膜化催乳素表达调节因子的研究较少。文章旨在探讨孤儿核受体Nur77在人子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中对蜕膜化标志基因(Prolactin,PRL)的作用。方法制备Ad-Flag-Nur77重组腺病毒,通过荧光素酶报告基因和荧光定量PCR结合重组腺病毒介导的Nur77过表达及小干扰RNA沉默Nur77基因的实验,阐述Nur77对蜕膜催乳素的调控作用。结果成功获得滴度为8×1010ifu/ml的重组Nur77腺病毒,该腺病毒可在子宫内膜间质细胞中高表达Flag-Nur77融合蛋白;体外培养的人子宫内膜间质细胞经8-Br-cAMP和甲羟孕酮(medroxy progesterone,MPA)刺激后,Nur77的表达明显增加,并在体外诱导蜕膜化培养的第3天达到高峰;过表达Nur77可明显上调人子宫内膜间质细胞中dPRL(-332/+65)启动子活性>4倍,并以浓度依赖的方式明显增加人子宫内膜间质细胞中PRL mRNA的表达,P<0.01;功能缺失实验进一步表明基因沉默内源性Nur77蛋白表达明显抑制dPRL启动子活性达60%,同时显著抑制8-Br-cAMP和MPA诱导的人子宫内膜间质细胞中PRLmRNA的表达,P<0.01。结论孤儿核受体Nur77参与8-Br-cAMP和MPA诱导子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达调控。