影响蜜蜂球囊菌侵染蜜蜂幼虫的因素及侵染过程观察

为探究蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis只侵染封盖前后蜜蜂幼虫的原因及相关侵染机制,本研究利用实验室饲养的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫,给其接种球囊菌孢子,探究不同接种量(0,1.0×102,1.0×103,1.0×104,1.0×105和1.0×106孢子/mL)、接种时期(3,4,5和6龄幼虫)以及28℃低温处理6h对蜜蜂球囊菌侵染的影响。同时对处于不同侵染阶段的蜜蜂幼虫做病理学切片,探究球囊菌侵染的过程。结果显示:球囊菌孢子接种量与蜜蜂的发病率密切相关(r=0.9883),蜜蜂幼虫对低于1.0×103孢子/mL的侵染有抗性,与不接孢子的对照组差异不显著(P>0.05)。蜜蜂不同龄期接种发病率的差异是因不同龄幼虫食量不同导致的摄入孢子剂量的不同引起的,28℃低温处理能够显著提高处于幼虫到蛹转化期蜜蜂的发病率(P<0.05),而对取食阶段的蜜蜂幼虫没有影响。病理学研究表明,在整个幼虫期,摄入的孢子因中肠没有氧气不生长,对幼虫没有致病性,幼虫的取食和发育过程正常,至幼虫期结束进入蛹期后,蜜蜂的中后肠接通,摄入的孢子伴随蜜蜂的蛹便进入后肠并在此迅速萌发生长,在1～2d内菌丝即突破体表,导致蜜蜂死亡。蜜蜂球囊菌选择营养物质储存最多而防御能力较低的幼虫到蛹转化期侵染,降低了侵染成本,提高成功率。该研究阐明了蜜蜂球囊菌侵染蜜蜂的机制,丰富了昆虫与病原菌之间相互作用的内容。

温度、相对湿度和pH对蜜蜂球囊菌孢子萌发的影响

研究了温度、相对湿度和 pH对蜜蜂球囊菌 (Ascosphaeraapis)孢子萌发 3个阶段 (活化、膨大、产生萌发管 )的影响 .结果表明 ,孢子活化和膨大在 15～ 40和 (2 5～ 40 )± 0 5℃范围内受温度的影响不明显 (P >0 0 5 ) ;萌发管仅发生在 2 5～ 37± 0 5℃ ,最适温度位于 (31～ 35 )± 0 5℃ .相对湿度越大 ,越有利于孢子萌发 ,而相对湿度低于 80 %对孢子萌发极为不利 .孢子萌发的 3个阶段在 pH为 5～ 7 8时几乎不受 pH变化的影响 ,而在 pH值较低影响很大 .可见 ,A .apis是一种高度专一的蜜蜂幼虫病原体 .

蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫

对健康和患病蜜蜂幼虫血淋巴进行SDS-PAGE电泳和蛋白酶、酯酶的活性染色,以研究蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶种类及对蜜蜂侵染的作用.结果表明:健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富,主要由4种高分子质量的蛋白组成,而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白组分被降解;在患病幼虫血淋巴中可以检测到健康幼虫所没有的多种蛋白酶和酯酶的活性.可见,蜜蜂球囊菌在侵染蜜蜂幼虫的过程中涉及到胞外酶的作用,这些胞外酶参与降解蜜蜂的组织,为蜜蜂球囊菌的生长提供营养.

营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响

从碳源、氮源、维生素、矿质元素等方面研究了营养生态条件对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis Olive＆Spiltoir)生长及产孢的影响。结果表明,营养生态条件的变化对蜜蜂球囊菌的影响极大。A.apis菌丝体生长最好的碳源是果糖,产孢量最高的是葡萄糖,不利用山梨糖和甘露糖;该菌优先利用有机氮源,不利用无机氮源中NaNO_2、H_2NCSNH_2;维生素对A.apis产孢量有极为显著的影响,复合维生素比单一维生素能更好地促进菌丝体生长,尤其对产孢更为有利;矿质元素中Mg^(2+)、P^(5+)、K^+、Zn^(2+)促进菌丝体生长和孢子的形成,Na^+对菌丝体的生长有抑制作用。

环介导等温扩增(LAMP)技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。[方法]根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3(5'-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3')、A.apis-B3(5'-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3')、A.apis-FIP(5'-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3')和A.apis-BIP(5'-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3'),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg^(2+)终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^(-1),dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^(-1),内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^(-1),甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mo1·L-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)、蜜蜂残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)和以色列急性麻痹病毒(Israel acute paralysis virus,IAPV)基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^(-1)、0.2231×10^(-2)、0.2231×10^(-3)、0.2231×10^(-4)、02231×10^(-5)、0.2231×10^(-6)、0.2231×10^(-7)、0.2231×10^(-8)μg·μL^(-1)作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^(-1)Mg^(2+)、1.2 mmol·L^(-1)dNTPs、1.6 mmol·L^(-1)FIP/BIP、0.4 mol·L^(-1)甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^(-1)、0.2231×10^(-2)、0.2231×10^(-3)、0.2231×10^(-4)、0.2231×10^(-5)μg·μL^(-1)作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^(-6)μg·μL^(-1)。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。

蜜蜂球囊菌荧光PCR快速检测方法的建立及应用

以蜜蜂球囊菌ITS1、ITS2和5.8 S rDNA保守序列(U68313)为参考,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,建立了一种快速检测蜜蜂球囊菌的荧光PCR方法。该方法灵敏度达1 ng/μL的阳性DNA比常规PCR高10倍。检测的特异性高,与蜜蜂幼虫芽胞杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应,同时可避免常规PCR因电泳造成的污染。应用该方法对蜜蜂及蜂制品的实际样品和模拟样品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法在4 h内即可报告结果,与传统病原菌分离培养、常规PCR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可以用于蜜蜂及其制品中蜜蜂球囊菌的快速检测和进出境检疫。

大蒜素对蜜蜂球囊菌的抑菌和杀菌活性研究

本研究旨在探明大蒜素对蜜蜂白垩病的病原菌蜜蜂球囊菌在体外的抑菌和杀菌活性。试验以蜜蜂球囊菌为受试菌,采用琼脂倍比稀释法测定最小抑菌浓度(MIC),采用琼脂培养基法测定最小杀菌浓度(MBC),测试大蒜素对蜜蜂球囊菌的体外抑菌和杀菌活性。结果表明,大蒜素对蜜蜂球囊菌的MIC为12.0mg/mL,MBC为24.0mg/mL。证实大蒜素在体外对蜜蜂球囊菌具有较好的抑菌和杀菌作用。

丁香等11种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)的抑制作用研究

蜜蜂白垩病是当前养蜂生产上危害严重的一种真菌传染病,为探寻安全控制蜜蜂白垩病的方法,本研究制备了1 1种中药的水浸提液,并配置了3种不同稀释度的含药培养基,研究蜜蜂球囊菌在不同含药培养基中的生长情况。结果表明:(1)配置稀释度为10^(-1)的中草药水浸提液和对照组比,对蜜蜂球囊菌均没有显著的抑制作用(P>0.05)。(2)配置稀释度为3×10^(-1)的中草药水浸提液和对照组比,丁香、黄柏两种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌具有极显著的抑制作用(P<0.01),而其他的中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌均没有显著的抑制作用(P>0.05)。(3)配置较稀释度为6×10^(-1)的中草药水浸提液和对照组比:红花、茵陈、百部、陈皮四种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌均没有显著的抑制作用(P>0.05);苦参、防己、女贞子、五味子、桃仁五种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌均有显著的抑制作用(P<0.05);丁香、黄柏两种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌具有极显著的抑制作用(P<0.01),该结果为利用中草药治疗蜜蜂白垩病提供了理论依据。

蜜蜂球囊菌检测分子标记的灵敏性测定

蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是蜜蜂白垩病的重要病原物,传统的鉴定方法是以形态学、生物学、培养条件等方面的特征为基础,这些特征差异并不明显,给以形态学特征来鉴定Ascosphaera属下各种的工作带来不可逾越的困难。A.apis检测分子标记可以用于准确检测该病原物。本研究利用该检测分子标记,结合PCR技术,分别检测不同浓度的A.apisDNA溶液,以测定该检测分子标记的灵敏性。试验结果表明,A.apis检测分子标记的最低检测DNA模板浓度为1.74×10-7ng/μl,即在25μl的PCR反应体系中加入4.34×10-6ng的A.apis的DNA样品,检测结果即可呈阳性,初步测定该检测分子标记具有较高的灵敏性。本研究为下一步利用该分子标记构建一套以PCR为基础的快速、可靠的检测方法以及应用于蜜蜂白垩病的快速诊断奠定基础。

蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性与菌株毒力关系的研究

为了探讨蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)胞外蛋白酶活性(PU)与其毒力的关系,评价胞外蛋白酶活力作为毒力指标的可靠性。本研究测定了9个不同来源地的蜜蜂球囊菌菌株的胞外蛋白酶活性及接种后各日累积蜜蜂幼虫死亡率和致死中时(LT50),将胞外蛋白酶活性与接种后各日累积死亡率及致死中时(LT50)进行回归分析,以确定胞外蛋白酶活性与其对蜜蜂幼虫的毒力间的相关性。结果表明各菌株胞外蛋白酶活性与其毒力间的存在显著相关性。因此,蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性可作为大量菌株筛选的参考毒力指标,但不能作为测定相关性的唯一指标。

蜜蜂球囊菌全长cDNA文库的构建与分析

本试验利用TRIzol试剂盒提取蜜蜂球囊菌总RNA,通过Oligotex纯化试剂盒将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得蜜蜂球囊菌cDNA原始文库,其滴度测定为1.6×106PFU/mL,扩增后的滴度是1.5×109PFU/mL;取适量扩增文库稀释并铺平板,蓝白斑筛选独立噬菌斑,用M13±通用引物进行PCR扩增后,文库的重组率达到90%,插入cDNA片段的长度在0.5-2 kb。该文库的构建,有利于筛选目的基因,便于深入研究蜜蜂白垩病的侵染机制,最终有效防制白垩病。

蜜蜂球囊菌的参考转录组de novo组装及SSR分子标记开发

【目的】通过RNA seq技术对纯培养的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子和球囊菌侵染的蜜蜂幼虫肠道组织进行测序,de novo组装球囊菌的参考转录组,并对其进行功能与代谢通路注释,进而基于该转录组数据开发球囊菌的SSR分子标记。【方法】首先通过差速离心获得活化的球囊菌孢子,配制含1×107孢子/m L的饲料饲喂4,5和6日龄的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫和中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫,通过Illumina Hi SeqTM2500平台同时对上述蜜蜂幼虫肠道及纯化球囊菌孢子进行深度测序,原始数据过滤后通过Trinity软件组装得到unigenes,进而通过BLASTX比对NCBI Nr,Swiss-Prot,KOG和KEGG数据库对unigenes进行功能与代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计SSR特异性引物,通过PCR对不同来源的球囊菌SSR位点进行扩增。【结果】本研究共获得146 135 308条高质量reads,de novo组装得到42 609个unigenes。BLASTX比对结果显示,29 316个unigenes在上述公共数据库中具有功能和代谢通路注释。注释到法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous上的unigenes最多,达6 050个。KEGG注释结果显示,unigenes可注释到117个代谢通路,其中富集在核糖体(ribosome)上的unigenes数量最多(529)。所有unigenes中共预测到7 968个SSRs,通过PCR开发出5个球囊菌SSR分子标记。【结论】本研究成功组装球囊菌的参考转录组,并进行了功能与代谢通路注释,可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。基于该转录组信息开发的5个SSR分子标记可推动菌株鉴定、基因图谱构建及基因定位等研究。

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的比较转录组分析

为探究实验室条件下纯培养的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)菌丝(AaM)和孢子(AaM)的共有基因、特有基因以及差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)与真菌的生长、发育、生殖和致病性的相关性,利用RNA-seq技术和生物信息学方法对AaM和AaS进行比较转录组分析,并结合实时荧光定量PCR验证转录组数据的可靠性.分析结果显示AaM和AaS的共有基因为7362个,涉及44个功能条目和122条通路;二者的特有基因分别为195和278个.AaM vs AaS比较组含有977个上调基因和687个下调基因,分别涉及32和32个功能条目;此外,上述DEG还涉及糖酵解/糖异生、次级代谢物的生物合成等113条通路.基于比较转录组分析发现球囊菌菌丝和孢子的共有基因、特有基因和DEG可能通过调节细胞活动、代谢进程、内吞作用以及MAPK信号通路等关键途径参与球囊菌的生长、发育和生殖过程.

基于RNA-seq数据大规模挖掘蜜蜂球囊菌的SSR分子标记

基于已获得的球囊菌转录组数据预测微卫星标记(SSR),并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的挖掘.利用软件MISA对球囊菌转录组中42610条unigenes进行搜索,共预测出7968个SSRs,分布于5233条unigenes中,其中最主要的重复类型为三核苷酸重复(53.15%),其次为二核苷酸重复(32.32%)和四核苷酸重复(8.46%).二核苷酸重复中的基序主要是AG/CT(占总量的15.8%).针对所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件设计出6956对SSR特异性引物,随机选取20对引物对两个不同来源的球囊菌样品进行SSR位点扩增,共有6对引物成功扩增出符合预期的目的片段.研究结果表明,利用球囊菌转录组数据开发SSR引物是可行的.

蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)原生质体制备及再生

为建立高效稳定的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)遗传转化体系,构建具有不同表型特征的球囊菌转化子,本实验对影响蜜蜂球囊菌菌株原生质体制备及再生的因子进行了系统的研究,同时对蜜蜂球囊菌原生质体的释放及再生过程进行了显微观察。结果表明,采用液体培养基进行24 h培养的蜜蜂球囊菌菌体,在28℃条件下,应用50 mg/mL的崩溃酶,经4 h酶解所制备的原生质体释放量最大,达到34.00×105/mL。在上述条件下,采用0.8 mol/L柠檬酸与NaCl的混合液作为稳渗剂,原生质体的再生率也较高,达到53.06%。蜜蜂球囊菌以菌丝断裂方式释放原生质体,原生质体再生时表现为原生质体先是突出,其后延长,并最终发育成为正常菌丝。本实验首次优化了蜜蜂球囊菌原生质体制备实验流程及原生质体再生最佳条件,为深入研究蜜蜂球囊菌的致病机理及寻找蜜蜂球囊菌致病相关基因奠定基础。

金属离子对蜜蜂球囊菌几丁质酶活力的影响

探讨了不同金属离子对蜜蜂球囊菌几丁质酶活力的影响.结果表明:在0-100 mmol.L-1范围内,一价金属离子Na+、K+随离子浓度的增大,对几丁质酶活力的影响表现为先促进后抑制;在1-10 mmol.L-1范围内,二价金属离子Mg2+、Mn2+起抑制作用,Zn2+基本没有影响,Ca2+、Fe2+起促进作用;在1-10 mmol.L-1范围内,三价金属离子A l3+起促进作用,Fe3+基本没有影响.

利用第三代纳米孔长读段测序技术构建和注释蜜蜂球囊菌的全长转录组

【目的】利用第三代纳米孔(nanopore)长读段测序技术对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)的纯化菌丝(Aam)和孢子(Aas)进行测序,构建和注释球囊菌的高质量全长转录组。【方法】通过Oxford Nanopore PromethION平台对Aam和Aas进行测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行碱基识别(base calling),通过过滤短片段和低质量原始读段得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。通过比对Nr、Swissprot、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库获得全长转录本的注释信息。分别利用CPC、CNCI、CPAT、Pfam 4种方法对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)进行预测,取四者的交集作为高可信度的lncRNA。【结果】Aam和Aas的纳米孔测序分别测得6321704和6259727条原始读段,经质控得到5669436和6233159条有效读段,其中包含的全长有效读段分别为4497102(79.32%)和4963101(79.62%)条。共鉴定到9859和16795条非冗余全长转录本,N50分别为1482和1658 bp,平均长度分别为1187和1303 bp,最大长度分别为6472和6815 bp。Venn分析结果显示有6512条非冗余全长转录本为菌丝和孢子所共有,分别有3347和10283个非冗余全长转录本为二者特有。此外,在球囊菌菌丝和孢子中共鉴定到20142条全长转录本,其中分别有20809、11151、17723、12164、11340和9833条全长转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库。注释全长转录本数量最多的物种是球囊菌、Polytolypa hystricis和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。GO数据库注释结果显示,上述全长转录本可注释到45个功能条目,涉及细胞组件、细胞和细胞器等细胞组分相关条目;催化活性、结合和转运器活性等分子功能相关条目;以及细胞进程、代谢进程和单一组织进程等生物学进程相关条目。KEGG数据库注释结果显示,上述全长转录本还可注释到抗生素的生物合成、核糖体、氨基酸的生物合成、碳代谢和剪接体等49条通路。此外,鉴定到648条高可信度的lncRNA,包含480条基因间区lncRNA、119条反义链lncRNA和49条正义链lncRNA。【结论】构建和注释了球囊菌的首个高质量全长转录组,为探究球囊菌转录组的复杂性,完善参考基因组的序列和功能注释信息以及深入开展球囊菌可变剪接体的功能研究提供了关键依据。

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中长链非编码RNA的比较及潜在功能分析

【背景】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,可引起成年蜜蜂数量和蜂群群势的急剧下降。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类新近发现的非编码RNA,在表观遗传、细胞周期、剂量补偿等众多生命活动中发挥重要生物学功能。【目的】明确球囊菌菌丝和孢子中lncRNA的数量、种类和表达谱差异,并探究共有lncRNA、特有lncRNA和差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA)在菌丝与孢子中的潜在功能。【方法】利用基于链特异性建库的lncRNA-seq技术对球囊菌的纯化菌丝(AaM)和纯化孢子(AaS)分别进行测序。根据FPKM(Fragment Per Kilobase of per Million mapped reads)法计算lncRNA在AaM和AaS中的表达水平。通过Venn分析筛选AaM与AaS的共有lncRNA和特有lncRNA。按照P≤0.05且|log2 fold change|≥1的标准筛选AaM vs AaS比较组中的DElncRNA。通过Blast工具将共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的上下游基因比对GO和KEGG数据库,以进行功能及通路注释。根据靶向结合关系构建共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络并利用Cytoscape软件进行可视化。利用RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】AaM和AaS分别测得108614646和105675408条原始读段(raw reads),经严格过滤得到107780032和104621402条有效读段(clean reads),Q20分别为98.76%和98.72%,Q30分别达到95.84%和95.78%。共鉴定到850个lncRNA。AaM和AaS的共有lncRNA为701个,二者的特有lncRNA分别为39和110个。上述共有lncRNA通过顺式作用调控3992个上下游基因,它们涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等42个功能条目,以及代谢途径、次生代谢物的生物合成和抗生素的生物合成等117条通路;AaM的特有lncRNA和AaS的特有lncRNA通过顺式作用分别调控243和672个上下游基因。AaM vs AaS比较组包含的255个DElncRNA通过顺式作用调控1479个上下游基因,它们涉及代谢进程、细胞进程和催化活性等41个功能条目,以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成和抗生素的生物合成等107条通路。从共有lncRNA、孢子特有lncRNA和DElncRNA中分别预测到41、5和13个微小RNA(microRNA,miRNA)的前体序列。调控网络分析结果显示,菌丝lncRNA、孢子lncRNA形成较为复杂的ceRNA调控网络;菌丝lncRNA可靶向结合8个miRNA,进而调控77个mRNA;孢子lncRNA可靶向结合7个miRNA,进而调控87个mRNA;2个DElncRNA(TCONS00008630与TCONS00009302)可靶向结合miR-4968-y,进而调控10个mRNA。RT-qPCR验证结果显示4个DElncRNA的差异表达趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可靠。【结论】共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA可能通过调控上下游基因的表达,作为miRNA的前体,以及充当ceRNA影响菌丝和孢子的物质和能量代谢、自噬、转录、MAPK信号通路、泛素介导的蛋白水解、蛋白酶体以及次生代谢产物的生物合成等生物学过程,从而调节球囊菌的生长、发育、生殖和致病性。

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中全长转录本的差异表达分析

【目的】本研究旨在探究蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称“球囊菌”)菌丝(Aam)和孢子(Aas)中的全长转录本与菌丝生长、孢子萌发以及有性生殖的相关性。【方法】将前期获得的Aam和Aas的Nanopore长读段测序数据中的有效读段与球囊菌参考基因组注释的已知转录本进行序列比对,获取全长转录本与已知转录本的对应信息。利用生物信息学方法对Aam和Aas的全长转录本进行差异表达、功能注释以及结构特征分析。【结果】Aam和Aas共有的全长转录本数量为19966条,特有的全长转录本数量分别为1273和2856条。Aas vs Aam比较组含有3230条差异表达转录本(differentially expressed transcripts,DETs),包含3072条上调和158条下调。GO功能注释结果显示,这些DETs涉及代谢进程、细胞、催化活性等GO条目。KEGG注释结果显示,这些DETs注释到内吞作用、MAPK信号通路、糖酵解/糖异生、碳代谢以及氨基酸的生物合成等相关通路。进一步分析发现,部分全长转录本的剪接异构体在Aam和Aas中具有不同的表达量和结构。【结论】本研究发现球囊菌在菌丝和孢子两个不同阶段伴随着转录本表达量和结构的变化,研究结果为深入探究不同剪接异构体在球囊菌的菌丝生长、孢子萌发和有性生殖中的分子功能提供了理论依据和数据基础。

基于蜜蜂球囊菌纳米孔测序数据的基因非翻译区延长、SSR位点发掘及未注释基因和转录本鉴定

【目的】利用已获得的纳米孔长读段测序数据完善现有的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis参考基因组注释信息,并对未注释的新基因和新转录本进行鉴定和功能注释。【方法】基于已获得的纳米孔长读段测序数据,采用gffcompare软件将蜜蜂球囊菌全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,进而对参考基因组注释基因的非翻译区(untranslated region,UTR)进行延长。利用TransDecoder软件对蜜蜂球囊菌基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)及相应的氨基酸序列进行预测。通过MISA软件发掘长度在500 bp以上的全长转录本的SSR位点。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr,KOG,eggNOG,Swiss-Prot,Pfam,GO和KEGG数据库进行功能注释。【结果】共对蜜蜂球囊菌的9481个基因进行了UTR延长,其中5′UTR和3′UTR延长的基因分别有4744和4737个。共预测出10492个完整ORF,其中编码长度分布在0~100和100~200个氨基酸的ORF最多,分别占ORF总数的38.96%和36.90%。共鉴定到5286个SSR,其中单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复的SSR分别为1870,826,2398,138,43和11个。共鉴定到1558个新基因,其中有1556,731,330,592,1177,709和589个新基因可分别被注释到Nr,Swiss-Prot,Pfam,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库。此外,还鉴定到14403条新转录本,其中有14376,8524,7276,7405,12035,7891和6855条新转录本可分别被注释到上述7个数据库。【结论】本研究利用已获得的纳米孔长读段测序数据对蜜蜂球囊菌的完整ORF进行了预测,对参考基因组的已注释基因进行了UTR延长,对未注释的SSR位点进行了发掘,此外还鉴定到大量未注释的新基因和新转录本,并对它们进行了功能注释。研究结果较好地完善了现有的蜜蜂球囊菌的基因组注释,为其组学和分子生物学研究的深入开展提供了基础。