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蜜蜂螺原体几丁质脱乙酰酶基因的克隆、表达及酶学性质
被引量:
2
1
作者
危蓉萍
杨东航
+2 位作者
卜莹莹
纪燕玲
于汉寿
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期417-424,共8页
[目的]通过表达载体p ET-28a(+)在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因chid,并测定其部分酶学性质,为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程...
[目的]通过表达载体p ET-28a(+)在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因chid,并测定其部分酶学性质,为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。[方法]利用Overlap Extension PCR(OE-PCR)定点突变技术,在引物设计时插入目的突变,通过3次PCR获得突变后的目的片段,测序验证后构建重组质粒p ETchid,挑取BLchid表达菌株。IPTG诱导表达目的蛋白,NTA-Ni2+柱纯化,Western blotting验证,紫外分光光度法测定其酶活力和酶学性质。[结果]DNA测序结果表明:chid基因中待突变位点已由TGA突变为TGG,成功克隆到chid基因全长,并得到外源表达的完整目的蛋白。该基因编码区为672 bp,编码的氨基酸构成相对分子质量约28×103的蛋白,同源性比较发现其与S.melliferum KC3/BC3/IPMB4A菌株序列相似性为97%。测得外源表达的该酶活力最高可达10.14 U·m L-1,最适温度为50℃左右,最适p H值为7.0~7.5。[结论]首次克隆了螺原体几丁质脱乙酰酶基因chid,并得到具有活性的外源目的蛋白,为后续研究螺原体与宿主蜜蜂的相互作用及其致病机制提供了重要信息。
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关键词
蜜蜂螺原体
几丁质脱乙酰酶
定点突变
克隆表达
酶学性质
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职称材料
题名
蜜蜂螺原体几丁质脱乙酰酶基因的克隆、表达及酶学性质
被引量:
2
1
作者
危蓉萍
杨东航
卜莹莹
纪燕玲
于汉寿
机构
南京农业大学生命科学学院/农业部农业环境微生物重点实验室
出处
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期417-424,共8页
基金
国家自然科学基金项目(30870002)
文摘
[目的]通过表达载体p ET-28a(+)在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因chid,并测定其部分酶学性质,为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。[方法]利用Overlap Extension PCR(OE-PCR)定点突变技术,在引物设计时插入目的突变,通过3次PCR获得突变后的目的片段,测序验证后构建重组质粒p ETchid,挑取BLchid表达菌株。IPTG诱导表达目的蛋白,NTA-Ni2+柱纯化,Western blotting验证,紫外分光光度法测定其酶活力和酶学性质。[结果]DNA测序结果表明:chid基因中待突变位点已由TGA突变为TGG,成功克隆到chid基因全长,并得到外源表达的完整目的蛋白。该基因编码区为672 bp,编码的氨基酸构成相对分子质量约28×103的蛋白,同源性比较发现其与S.melliferum KC3/BC3/IPMB4A菌株序列相似性为97%。测得外源表达的该酶活力最高可达10.14 U·m L-1,最适温度为50℃左右,最适p H值为7.0~7.5。[结论]首次克隆了螺原体几丁质脱乙酰酶基因chid,并得到具有活性的外源目的蛋白,为后续研究螺原体与宿主蜜蜂的相互作用及其致病机制提供了重要信息。
关键词
蜜蜂螺原体
几丁质脱乙酰酶
定点突变
克隆表达
酶学性质
Keywords
Spiroplasma melliferum
chitin deacetylase
site-directed mutagenesis
cloning and expression
enzymatic characterization
分类号
Q938 [生物学—微生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
蜜蜂螺原体几丁质脱乙酰酶基因的克隆、表达及酶学性质
危蓉萍
杨东航
卜莹莹
纪燕玲
于汉寿
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016
2
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