蜱传脑炎概况及其防治研究进展

蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)是引起中枢神经系统疾病——蜱传脑炎(Tick-borne encephalitis,TBE)的病原体,可在人与动物中引起致死性脑炎并伴有长期的后遗症,严重影响人类健康与公共卫生安全。近年来随着气候变化以及人类对自然资源的开发,蜱传脑炎发病率不断升高,但目前尚无有效的治疗药物,靶向抗病毒药物的研发是治疗病毒感染的主要方向之一。蜱传脑炎的预防主要集中在减少传播媒介蜱的叮咬上。本文对蜱传脑炎病毒的病原学特征、临床特征、检测诊断方法以及防治措施进行综述,以期为相关研究提供参考。

蜱传脑炎病毒感染BALB/c小鼠模型的建立

本文建立了蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)感染的动物模型,为筛选抗TBEV药物提供合适的工具。选取BALB/c小鼠,经皮下注射途径接种TBEV,观察其感染症状、体重及生存率。检测小鼠脑、脾、肾组织中TBEV抗原分布、病毒滴度、组织病理和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、干扰素β(interferonβ,IFN-β)mRNA表达水平的动态变化。结果表明,感染小鼠出现弓背、后肢瘫痪的症状;与未感染病毒的小鼠相比,感染小鼠的体重及生存率显著降低;TBEV抗原分布在小鼠的脑、脾、肾组织;脑组织中病毒滴度高且发生病理改变;感染鼠脑、脾、肾组织中TNF-α与IFN-βmRNA的表达水平呈动态变化。本文采用皮下注射攻毒途径成功建立了TBEV感染的BALB/c小鼠模型。

新疆中哈边境地区分离到远东型和西伯利亚型蜱传脑炎病毒

目的研究新疆中哈边境阿拉套山夏尔西里自然保护区蜱传脑炎疫源地病原的基因型及生物学特征。方法采用布旗法采集蜱,活蜱保存或液氮冻存;采用BALB/c小鼠与BHK-21细胞进行蜱传脑炎病毒分离培养;采用RT-PCR扩增蜱传脑炎病毒远东型FE和西伯利亚型S特异基因片段并测定其序列。结果从新疆中哈边境阿拉套山夏尔西里自然保护区全沟硬蜱和森林革蜱中分离出16株蜱传脑炎病毒株,通过对扩增基因序列比对分析,明确其中13株为远东型,3株为西伯利亚型。结论从新疆中哈边境阿拉套山夏尔西里自然保护区分离到远东型和西伯利亚型蜱传脑炎病毒,该地区为两种亚型病毒共存的蜱传脑炎自然疫源地。

蜱传脑炎病毒E基因的重组质粒构建及其在原核细胞的表达

通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌内表达蜱传脑炎病毒E蛋白。结果表明:经过PCR试验和双酶切试验鉴定,克隆测序正确,通过重组质粒,成功地表达出蜱传脑炎病毒E蛋白。

蜱传脑炎病毒东北株E蛋白的核酸和氨基酸序列

从我国东北林区死者脑组织中，分离到蜱传脑炎病毒ＨＬＪ－１株，测定了它的Ｅ蛋白基因序列和推导的氨基酸序列，以及Ｅ蛋白抗原位点反应图谱。将该株与远东亚型Ｓｏｆｙｎ株和中欧亚型Ｎｅｕｄｅｒｆｌ株做了同源性比较，ＨＬＪ－１株与Ｓｏｆｙｎ株Ｅ蛋白基因的核苷酸及氨基酸的同源性分别为９４．３％和９８．８％；与Ｎｅｕｄｏｅｒｆｌ的核苷酸和氨基酸的同源性分别为８３．７％和９６％，在Ｅ蛋白的核苷酸序列中，ＨＬＪ－１和Ｓｏｆｙｎ株之间存在着８５个碱基的变异和６个氨基酸的改变，变化的氨基酸分别是Ｓｅｒ－４３８→Ｇｌｙ，Ａｒｇ－４５１→Ｌｙｓ，Ａｌａ－６１２→Ｖａｌ，Ｍｅｔ－６３８→Ｉｌｅ，Ａｓｎ－６４６→Ｔｈｒ，Ｖａｌ－６８２→Ａｌａ。从Ｅ蛋白的模型得知，变异的氨基酸位于Ｅ蛋白的保守区域，故对抗原性影响不大。另Ｅ蛋白位点总图谱显示，ＨＬＪ－１与Ｓｏｆｙｎ株在Ｃ位点的反应存在差异，这可能是由于培养液低ｐＨ引起ＨＬＪ－１的空间结构改变所致。本文首次从基因水平证实了从东北林区分离的蜱传脑炎病毒属于远东型蜱传脑炎病毒。

蜱传森林脑炎病毒非结构蛋白1原核表达载体的构建

目的:构建蜱传森林脑炎病毒(TBEV)非结构蛋白1(NS1)的原核表达载体,以期获得其高纯度的表达,为制备多克隆抗体及其功能的研究奠定实验基础。方法:根据目的基因序列设计PCR引物,利用基因重组技术构建原核表达载体pEASYTM-E1-NS1。将重组后质粒pEASYTM-E1-NS1转化至BL21细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后进行镍离子亲和纯化,利用Bradford法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE和Western blotting法分析融合蛋白的表达水平。结果:含TBEV NS1的原核表达载体pEASYTM-E1-NS1经诱导后,可获得以包涵体形式存在的融合蛋白,通过亲和纯化得到较高纯度的蛋白质。SDS-PAGE和Western blotting,在相对分子质量约40 000处有特异性蛋白条带。结论:成功构建重组pEASYTM-E1-NS1原核表达载体,获得高纯度的重组TBEV NS1的融合蛋白。

引起人类疾病的蜱传病毒研究进展

目前全球发现的蜱传病毒(tick-born virus,TBV)种类繁多,其中能引起人类疾病的TBV主要包括:内罗病毒科(Nairoviridae)、白蛉病毒科(Phenuiviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)和呼肠孤病毒科(Reoviridae)5科14种病毒,本文就引起人类疾病的TBV的分类、所致人类疾病、传播媒介、宿主动物、分布和预防进行了综述。

蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用？

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS），本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM-E与荧光素酶融合蛋白，并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增prM-E抗原基因，连接到pNLF1-secN质粒上构建真核表达载体pNLF-prM-E，使prM-E蛋白与荧光素酶串联融合表达，并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示，转染重组质粒pNLF-prM-E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达；进而用间接免疫荧光试验（ IFA）检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合；在此基础上，用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测，从20份患者血清中检出19份阳性，7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性，可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。

蜱传脑炎病毒TBE-E-D3抗原的原核表达纯化及ELISA方法鉴定

目的:构建蜱传脑炎病毒TBE-E-D3抗原的融合蛋白原核表达质粒GSTpET-30a(+)/TBE-E-D3,在大肠杆菌中诱导表达并用亲和层析法纯化,以获得特异性诊断抗原。方法:根据目的基因序列设计PCR引物,利用基因克隆技术构建重组质粒,转入大肠杆菌DH5α后经酶切鉴定,将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后进行亲和层析法纯化,SDS-PAGE分析其表达情况和纯度,间接ELISA法鉴定重组蛋白的特异性和灵敏度。结果:TBE-E-D3基因目的片段以正确的读框插入载体GSTpET-30a(+),通过IPTG诱导在大肠杆菌中正确表达,亲和纯化得到较高纯度的蛋白质;间接ELISA法证明抗原特异性和灵敏度良好,送检的15份阳性患者血清样本中检出10份阳性结果,40份健康人血清样本中检出1份假阳性结果。结论:获得的His-TBE-E-D3融合蛋白具有良好的抗原性,可作为森林脑炎病毒特异性血清学诊断的备选抗原之一。

蜱传脑炎病毒E抗原蛋白的原核表达及鉴定

目的:构建蜱传脑炎病毒(TBEV)结构蛋白E的原核表达载体,表达重组蛋白。方法:PCR扩增E蛋白全长基因片段,插入原核表达载体pET-32a并转化大肠杆菌进行诱导表达,镍柱纯化、复性。结果:E蛋白在大肠杆菌中获得表达,表达量达60 mg/L;重组E蛋白能与人抗TBEV多克隆抗体产生特异反应;用重组E抗原免疫家兔后,能检测到较高的抗体水平。结论:原核表达的E抗原蛋白具有抗体结合活性,可用于制备ELISA诊断试剂。

蜱传脑炎病毒感染小鼠脑组织单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、CD68和核因子κB(NF-κB)表达增加

目的探讨蜱传脑炎病毒(TBEV)感染小鼠单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、CD68和核因子κB(NF-κB)表达情况。方法1周龄BALB/c小鼠8只,随机分为对照组和感染组,分别进行PBS或TBEV颅内注射。感染8 d后处死取一半脑组织固定,HE染色检测脑组织病理改变;免疫组织化学染色法检测小鼠大脑MCP-1、NF-κB和CD68的表达,镜下观察并统计阳性细胞数量;免疫荧光化学染色法结合激光扫描共聚焦显微镜观察MCP-1和CD68的共表达情况。结果与对照组相比,TBEV感染后小鼠脑组织MCP-1、NF-κB和CD68阳性细胞数均显著增加,MCP-1在CD68阳性及非阳性细胞中均有表达。结论TBEV感染小鼠CD68、NF-κB、MCP-1表达增强。

蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的真核表达优化及其在血清学检测中的效果评价

目的:优化蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的密码子,提高其在真核系统中的表达量,为蜱传脑炎病毒感染血清的检测提供更为有效的检测抗原。方法:对蜱传脑炎病毒MDJ01株E蛋白胞外区进行真核密码子优化,获得优化的胞外区蛋白基因序列OPT-EC;将抗原基因与海肾萤光素酶基因Rluc融合构建重组质粒pc DNA3.1-Rluc-OPT-EC、pc DNA3.1-Rluc-EC,用重组质粒转染COS7细胞获得融合抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC,并将融合抗原用于临床感染血清样本的免疫共沉淀检测以评价抗原的灵敏性和特异性。结果:真核密码子优化显著提高了Rluc-OPT-EC的表达量;OPT-EC的检测灵敏度可达86%以上,其对乙型脑炎病毒(JEV)感染血清、黄热病度(YFV)感染血清、禽流感病毒(AIV)感染血清和正常人血清的检测特异度高于90%,但是在西尼罗病毒(WNV)感染血清和登革病毒(DV)感染血清的检测中发生了交叉反应。结论:优化后的E蛋白胞外区蛋白作为TBEV感染的检测抗原,能够有效地区分JEV、YFV感染,但不能区分WNV和DV感染。

蜱携带重要人畜共患病毒研究概况

蜱能够传播多种病毒,已知有6个病毒科的病毒能通过蜱虫吸血传播,分别是黄病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科、弹状病毒科、呼肠孤病毒科和非洲猪瘟病毒科。除非洲猪瘟病毒科外,其余病毒均为核糖核酸(RNA)病毒。黄病毒科和布尼亚病毒科病毒可在人类引起脑炎和出血热,因此其意义尤为重要。森林脑炎病毒、波瓦生病毒和克里米亚—刚果热病毒等蜱传病毒引起的人畜共患疾病,近年来在世界上多个地区重新流行。新型蜱传病毒及相关病例不断被发现,例如我国发现的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)以及国外发现的Heartland和波本(Bourbon)病毒等,引起了医学界的广泛重视。随着人类对自然资源的开发,与自然界蜱的接触机会日益增加,导致蜱传病毒性疾病的发病率上升。为了做好及时应对这种潜在公共健康威胁的准备,本文对蜱及其携带的重要病毒特点进行了综述。

逆转录聚合酶螺旋反应快速检测蜱传脑炎病毒方法的建立及初步评价

目的建立一种等温条件下蜱传脑炎病毒(TBEV)的现场快速检测的方法。方法针对TBEV NS1基因设计一对特异性螺旋引物,在等温条件下建立逆转录聚合酶螺旋反应(RT-PSR)检测方法,优化反应条件,对特异性和灵敏性进行分析,应用全血模拟标本评价RT-PSR检测的符合率。结果成功建立并优化了TBEV的RT-PSR检测方法,RT-PSR法在61℃的温度下只需一种酶可一步实现逆转录和扩增,55 min可完成TBEV的检测,并可通过SYBR GreenⅠ直接肉眼判读结果,该方法特异性强,灵敏性高,最低检测限为107.341×10^(-6)ng/μL,是PCR的100倍。全血模拟标本符合率为100%,灵敏性比RNA标准品低10倍。结论RT-PSR方法具有良好的特异性和灵敏性,可用于基层对TBEV的现场快速检测。

蜱传脑炎病毒作模型、黄病毒囊膜蛋白E抗原的分子结构

蜱传脑炎(TBE)病毒是一种主要人类致病性黄病毒，在其结构蛋白中囊膜蛋白E具有重要的生物学活性，可诱导保护性免疫懂答，可使病毒结合到细胞受体上。因此，蛋白E的结构和功能就成了正确理解黄病毒生物学活性及病毒一细胞相互作用机制的中心环节。

新疆阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地调查

目的调查新疆阿勒泰山地蜱传脑炎疫源地特征,分离鉴定蜱传脑炎病毒。方法通过家畜体表捡法采集寄生蜱;利用间接免疫荧光法检测当地健康人群血清中蜱传脑炎病毒IgG抗体;通过将蜱研磨液接种实验小鼠进行病原动物分离;通过接种BHK-21细胞对蜱传脑炎病毒进行分离培养;利用RT-PCR方法对病毒E蛋白基因片段进行扩增和测序,通过序列分析明确病毒系统进化特征。结果新疆阿勒泰山地白哈巴地区分布有2种蜱,森林革蜱为优势种(55.6%),其次为边缘革蜱(44.4%);当地人群蜱传脑炎IgG抗体阳性率5.31%(6/113);通过动物试验和细胞分离培养,从森林革蜱中分离出一株森林脑炎病毒;对病毒E蛋白基因序列的系统进化分析表明,蜱传脑炎病毒阿勒泰分离株属于远东亚型。结论首次从病原学上证实新疆阿勒泰山地存在蜱传脑炎疫源地,媒介为森林革蜱,病毒流行株为远东亚型。

蜱传脑炎疫苗

上世纪蜱传脑炎 (TBE)是欧洲常见的病毒性中枢神经系统 (CNS)疾病 ,每年有数百例住院病例 ,致病因子是蜱传脑炎病毒 (TBEV) ,一种由蜱传播的黄病毒。2 0世纪 70年代早期开发了第一种组织培养疫苗 ,该疫苗上市使用 30年以来取得了良好的效果 ,显著降低了中欧 TBE的发病率 ,尤其是奥地利。本文论述了

森林脑炎病毒(TBEV)实时定量TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立快速检测TBEV的实时定量TaqMan PCR方法。方法根据GenBank发表的TBEV全基因组序列资料，在其C基因和NS5基因区段设计TBEV的特异探针和引物，在E基因区段设计普通PCR引物。以MDJ01株作为待检毒株，黄病毒属的另外7株病毒用来评价检测体系的特异性。测定病毒的TCID50值并制备病毒拷贝数标准品，分别用于制作病毒滴度和拷贝数标准曲线。与常规PCR方法进行了灵敏度比较，并建立了病毒感染小鼠的检测模型。结果该检测方法的灵敏度可达到100拷贝／反应或0．1TCID50，是常规PCR方法的十倍。作为对照的黄热病毒疫苗株17D、登革1～4型病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒Chin-01株结果均为阴性，证明该体系具有良好的特异性。经过多批次、不同浓度样品的重复检测，批内和批间变异系数均小于5％，表明该体系具有较好的稳定性和重复性。结论建立了一种灵敏、特异、简便易行的TBEV的TaqMan实时定量PCR检测方法，为TBEV的预防控制和诊断提供了一种技术手段。

蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5的研究进展

蜱传脑炎病毒是引起严重的中枢神经系统疾病蜱传脑炎的病原体,每年在欧洲、俄罗斯远东地区、日本和中国北部报道的蜱传脑炎病例数约为10000‒12000例,且在我国和多个欧洲国家的发病率逐渐增高,正成为人类健康的潜在危害。主动免疫是预防蜱传脑炎的有效措施,包括我国在内的多个国家已研制出安全性较高的疫苗,但在我国流行省份的疫苗接种较为有限,特异性抗病毒药物的研发或许是治疗蜱传脑炎病毒感染的研究方向之一。蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5因为在病毒基因组复制、加帽和宿主免疫调节中的重要作用,成为关键的抗病毒药物研发靶点。本文综述了蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5的三维结构和抑制剂研发工作,为深入探究该病毒感染的分子机制和抗病毒药物研发提供参考。

Dhori病毒核蛋白抗原表位的筛选及鉴定

目的研究鉴定DHOV核蛋白(NP)的最小线性B细胞表位(BCEs),为DHOV的疫苗研制和预防奠定基础。方法本研究针对DHOV-GRT169毒株NP蛋白进行生物信息学分析,采用改良生物合成肽法鉴定其BCEs。首先将DHOV NP蛋白截短为4个片段并鉴定其抗原性,将阳性片段继续截短成相互重叠8个氨基酸的16肽,将16肽序列分别克隆至原核表达载体pXXGST-3中表达,兔抗融合蛋白NP蛋白多克隆抗体作为一抗,用Western blotting检测16肽的抗原性,将检测出的阳性16肽都截短成相互重叠7个氨基酸的8肽,用同样的方法诱导表达及检测。最后用生物信息学方法分析每个BCEs在NP蛋白三维结构中的位置。结果从NP蛋白中最终鉴定出9个BCEs,分别为Enp1(^(3)NPTPKR^(8))、Enp2(^(7)KRAEPGD^(13))、Enp3(^(83)YUFFFL^(88))、Enp4(^(111)NQTLTDE^(117))、Enp5(^(224)QSQKAMLK^(231))、Enp6(^(227)KAMLKQIF^(234))、Enp7(^(418)LNAEFEEY^(425))、Enp8(^(421)EFEEYSKL^(428))、Enp9(^(432)GTGAFYER^(439)),均位于NP蛋白表面。结论这些鉴定的表位将提高对DHOV表位分布和致病机制的认识,为DHOV多表位检测抗原的开发提供基础,也可为DHOV感染与免疫机制研究提供理论依据。