蝉虫草及其寄生真菌产生免疫抑制剂多球壳菌素能力的鉴定

目的寻找能产生免疫抑制剂多球壳菌素(myriocin)的蝉虫草或其寄生真菌。方法选取蝉虫草原药材大蝉草和蝉花干燥品,蝉花寄生真菌蝉棒束孢菌(Cordyceps cicadae或Isaria cicadae Miq.BNCC114807)以及一种线虫草属蝉寄生真菌Ophiocordyceps sp.FU30231,通过聚合酶链式反应(PCR)法扩增内源转录间隔区(ITS)序列,鉴定各材料的菌种;分别以乙醇回流提取法和80%甲醇浸提法制备虫生真菌发酵液,并进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析;以多球壳菌素标准品为对照,寻找生产多球壳菌素的虫生真菌;通过大量发酵和分离鉴定多球壳菌素,最终确定其产源虫生真菌。结果ITS序列分析表明,蝉虫草原药材大蝉草和蝉花的寄生真菌分别为奇异弯颈霉(Tolypocladium paradoxum)和蝉棒束孢菌。提取液LC-MS分析结果表明,仅Ophiocordycepssp.FU30231中检测到多球壳菌素的产生。大量发酵并分离纯化后,采用核磁谱鉴定确证了Ophiocordycepssp.FU30231产多球壳菌素的能力。结论Ophiocordycepssp.FU30231首次被鉴定为免疫抑制剂多球壳菌素的生产菌株。

1株野生蝉虫草的鉴定及其胞内和胞外多糖抗肝癌活性比较

【目的】对1株野外采集的蝉虫草进行分离和鉴定,分析比较其发酵菌丝体胞内和胞外多糖的抗肝癌细胞HepG-2活性及多糖的组成。【方法】通过形态学特征和ITS序列分析,对供试菌株进行鉴定;采用MTT法、细胞划痕试验,比较供试菌株菌丝体胞内和胞外多糖对人肝癌细胞HepG-2的抑制活性以及对人正常肝细胞LO2的毒性,并通过高效液相色谱法和凝胶渗透色谱法,比较分析2种多糖的成分及分子质量分布。【结果】根据菌株形态学特征和ITS序列分析,供试菌株为蝉虫草Cordyceps cicadae;其胞内和胞外多糖均可极显著抑制HepG-2细胞活性(P<0.01),半数抑制浓度(IC50)值分别为3.23和0.45 mg/mL,细胞迁移率分别为38.72%和24.79%,提示胞外多糖比胞内多糖具有更强的抗肝癌细胞HepG-2活性;且2种多糖对人LO2细胞均无明显毒性;进一步分析发现,胞外多糖中半乳糖醛酸的含量是胞内多糖的23.53倍,其分子质量的94.1%集中在19.1~85.0 ku,胞内多糖中核糖是其特征性单糖,高分子质量多糖(>250.0 ku)分布占比明显高于胞外多糖。【结论】野生蝉虫草菌株发酵所产胞外多糖的抗肝癌细胞HepG-2活性较胞内多糖强,二者在单糖组成和分子质量分布上存在明显差异。

珍贵药材蝉虫草的鉴别与培育

竹林蝉虫草是一种珍贵的药材,野生数量极为稀少。本文主要介绍了蝉虫雌雄体鉴别技术、蝉虫草菌的寄生情况,同时探索了仿生培育和蝉虫粉人工代料栽培技术,以期为合理开发利用蝉虫草提供实践基础和理论依据。

蝉花虫草酒延寿及抗氧化作用的研究

通过果蝇寿命实验及果蝇体内SOD活性、MDA含量的测定,研究蝉花虫草酒的延寿及抗氧化作用。结果显示,白酒对果蝇寿命及抗氧化有负面作用,而蝉花的加入能抵消白酒的负面影响,并能一定程度上提高雌雄果蝇的平均寿命,半数死亡时间及最高寿命,提高果蝇体内的SOD活性,降低其MDA含量。综合所有实验结果,发现1.0%剂量的蝉花虫草酒延寿及抗氧化效果最为显著(p < 0.05)。

蝉花虫草液态培养条件优化

为了研究不同液体培养条件对蝉花虫草生长的影响,以菌丝生长量为考察指标,以碳源、氮源、无机盐、培养温度为考察因素,进行单因素实验和正交实验。在转速为150 r/min,接种量为5%的前提下,采用正交实验的方法最终确定培养基最佳配方为:可溶性淀粉20 g/L,蛋白胨15 g/L,KH_(2)PO_(4)1 g/L,最佳培养温度为28℃。在此条件下,蝉花虫草菌丝生长量为624.48±6.18 g/L。实验得到蝉花虫草液态培养的最佳培养基配方和培养温度,为蝉花虫草的液态培养条件优化提供了理论基础。

柞蚕蛹培养蝉花的孢子粉和孢梗束的代谢组分析

已有研究表明,人工培养蝉花与野生蝉花的功效非常相似,具有替代野生蝉花的潜力。本实验通过基于HPLC-TOF/MS的代谢组学的方法,将人工蝉花孢子部分和孢梗束部分进行代谢物组差异分析比较。分析柞蚕蛹培养的蝉花孢子部分和孢梗束部分代谢产物的差异,将为开发蝉花活性部位产品提供理论依据。结果表明,柞蚕蛹培养蝉花的孢子部分和孢梗束部分之间的代谢产物差异显著。经谱库检索鉴定,得到88个差异化合物,其中78个化合物在孢子部分含量较高。柞蚕蛹培养蝉花的孢子和孢梗束之间代谢组显著不同,孢子部分含有较多的生物活性物质和营养物质,因此,柞蚕蛹培养蝉花的孢子粉具有较大开发潜力。

蝉虫草样品的分级萃取与化学成分分析

利用索氏萃取技术,依次采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇和甲醇等5种溶剂对蝉虫草纯粉进行分级萃取,运用傅里叶变换红外光谱分析法和气相色谱-质谱联用技术对5级萃取物进行分析鉴定。傅里叶变换红外光谱分析显示萃取物中含有与烯烃类、羧酸类、酯类、醇类和酮类等化合物相关的C-H、C=O、C-O和C=C等官能团。气相色谱-质谱联用技术共鉴定出有机小分子化合物34种,以酯类和脂肪酸类为主,多为碳链长度为15–20的长链脂肪酸及对应的酯,其中十八碳不饱和脂肪酸相对含量高达28.95%;分别存在于两种或以上萃取物中的有机化合物共有11种;仅存于石油醚萃取物中的化合物6种,乙酸乙酯萃取物中3种,丙酮萃取物中2种,无水乙醇萃取物中6种,甲醇萃取物中6种。在一定极性范围内,利用溶剂的极性梯度变化,可实现蝉虫草中活性物质的按极性梯度分离;采用分级萃取技术可有效分离蝉虫草中部分化学成分。鉴定结果充实了蝉虫草中化合物的种类资源,为蝉虫草中活性物质谱图库的完善、构效关系的建立及蝉虫草产品的利用开发提供支撑。

蝉虫草(蝉花)来源的化合物鉴定与抗菌活性检测

蝉虫草(蝉花)是我国重要的传统中药材之一,用于治疗慢性肾炎等,但对其活性成分的研究仍不充分。本文采用硅胶柱、凝胶柱、ODS柱分离,以及HPLC等色谱技术,对蝉虫草子实体样品的乙酸乙酯提取物进行分离纯化,得到3个化合物。根据波谱学数据,化合物1–3分别鉴定为(E,E)-9-酮-10,12-十八碳二烯酸(E,E)-9-oxooctadeca-10,12-dienoic acid(1)、麦角甾醇ergosterol(2)和白僵菌酮bassiatin(3),其中化合物1为首次从蝉虫草中分离获得。抑菌实验表明,3个化合物均对革兰氏阴性大肠杆菌Escherichia coli和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有显著的抑菌活性,化合物1和3还对条件致病真菌白色念珠菌Candida albicans有明显的抑菌活性。本文的研究结果丰富了蝉虫草的活性化合物组成。

大蝉虫草发酵液抗真菌活性成分的分离与结构鉴定

采用杯碟法对大蝉虫草摇瓶发酵液的乙酸乙酯萃取物进行了抗菌实验,并利用质谱导向的制备高效液相色谱对该乙酸乙酯萃取物中的活性组分进行了跟踪分离得到抗菌活性化合物,根据该化合物的理化性质和波谱数据鉴定其化学结构。结果发现大蝉虫草发酵液的乙酸乙酯萃取物对白色念珠菌有明显的抑制作用,确定白色念珠菌为研究大蝉虫草发酵液抗菌活性的最佳指示菌;从大蝉虫草发酵液中分离得到的抗真菌活性化合物为多壳球菌素。

蝉虫草菌丝体胞内和胞外多糖抗肝细胞氧化损伤比较研究

蝉虫草(蝉花)作为我国传统的中药材,是一种药食两用的虫生真菌,因含有丰富的活性物质而具有广泛的医疗保健价值。本研究以自由基清除率为指标分析蝉虫草胞内和胞外多糖的化学抗氧化活性,再以H2O2诱导的人肝LO2细胞氧化损伤为模型,进而分析比较二者对肝细胞氧化应激损伤的改善作用。结果表明,在化学抗氧化能力比较上,蝉虫草菌丝体胞外多糖有效清除×OH自由基、ABTS自由基和DPPH自由基的EC50值分别为1.06mg/mL、0.96mg/mL和0.63mg/mL,而胞内多糖的EC50值分别为3.71mg/mL、2.83mg/mL和1.70mg/mL,表明蝉虫草胞外多糖的化学抗氧化能力更强;在改善细胞氧化应激损伤比较上,与模型组对比,二者均能随着浓度递增而显著地提高细胞存活率,但胞外多糖比胞内多糖更强,当多糖浓度为5mg/mL时,胞外多糖细胞存活率达到92.36%,胞内多糖只达到82.07%;在调节细胞抗氧化酶清除ROS的机制上,与模型组对比,胞外多糖分别上调SOD酶活力2.51倍和CAT酶活力2.91倍,极显著地降低了细胞ROS水平(P<0.01)来改善细胞的氧化应激损伤作用。相应地,胞内多糖只上调了1.85倍和2.33倍,显著性地清除了ROS(P<0.05),表明蝉虫草菌丝体胞外多糖具有更显著的抗肝细胞氧化损伤作用。本研究结果显示蝉虫草菌丝体胞外和胞内多糖均具有良好的抗肝氧化损伤活性,且胞外多糖比胞内多糖活性更好,为蝉虫草菌丝体多糖在保肝产品中的开发和应用提供了科学依据。

人工培育蝉花虫草的抗肿瘤活性

以天然蝉花虫草生药为对照,以中国仓鼠卵巢肿瘤(Chinese?hamster?ovary,CHO)细胞株为模型,采用刃天青染色法检测人工培育蝉花虫草的抗肿瘤活性。结果表明:人工培育蝉花虫草和天然蝉花虫草生药都具有抗肿瘤活性,且活性成分均为中等极性化合物。对人工培育蝉花虫草中的抗肿瘤活性成分进行分离制备,得到两种化合物,命名为化合物1和化合物2。化合物1经鉴定为虫草素,化合物2经纯度验证为纯品,活性验证结果发现当其质量浓度为50?μg/m L时,对CHO细胞抑制率高达(94.55±2.33)%。

蝉花虫草粗多糖对鸡新城疫抗体水平影响的研究

为了研究蝉花虫草粗多糖的免疫调节作用,试验分为新城疫弱毒苗和灭活苗免疫两部分。新城疫弱毒苗试验选择1日龄雏鸡300只,随机分为Ⅰ组(对照组)、蝉花虫草粗多糖低(Ⅱ)、中(Ⅲ)、高(Ⅳ)剂量组、Ⅴ组(黄芪组)。7~28日龄雏鸡灌服多糖或生理盐水,14,28日龄滴鼻点眼新城疫Ⅳ系弱毒疫苗,分离14,21,28,35,42,49,56日龄鸡血清并检测新城疫抗体效价。灭活苗试验选择53日龄鸡80只,分为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组,在63~65日龄时灌服多糖或生理盐水,63日龄时免疫新城疫油乳剂灭活疫苗2羽份,分离70,77,84日龄鸡血清并检测新城疫抗体效价。结果表明:在新城疫弱毒苗试验中,7~14日龄雏鸡添加100 mg/kg蝉花虫草粗多糖能有效延长新城疫母源抗体的保护期,提升成活率,且与弱毒苗作用后有效保护鸡群新城疫抗体水平维持在较高水平。在灭活苗试验中,对于60日龄鸡群,添加50 mg/kg蝉花虫草粗多糖可以起到明显提高新城疫抗体水平的效果。说明添加一定剂量的蝉花虫草粗多糖能有效提升鸡新城疫疫苗的免疫效果。

超声-微波协同提取蝉花虫草腺苷条件优化及不同产地腺苷测定

以野生蝉花虫草子实体为材料,采用超声-微波协同法提取蝉花虫草腺苷并对其提取条件进行优化,经单因素及正交实验,确定优化的提取条件:微波功率150 W、超声-微波协同提取时间120 s、料液比为1∶30、甲醇体积分数为20%,蝉花虫草腺苷提取率为(0.53±0.02)mg/g;并利用高效液相色谱法测定不同产地蝉花虫草菌丝体腺苷含量,结果表明:测得4个产地的蝉花虫草菌丝体腺苷含量为0.14~0.40 mg/g,其中井冈山分离获得JJS0017菌株的菌丝体腺苷含量最高(0.40 mg/g),其次为九江市莲花镇莲花林场分离获得JJS0007菌株,江西省鄱阳县饶埠镇分离获得JJS0032菌株的菌丝体腺苷最低(0.14 mg/g)。本文可为蝉花虫草的开发利用提供一定的理论依据。

蝉花虫草多糖脱蛋白研究

蝉花虫草粗多糖中杂有蛋白、核酸、酚类等物质,给多糖的分离纯化带来许多干扰,为了排除杂质干扰,获得较为纯净的多糖组分,采用Sevag法和大孔树脂吸附法相结合对蝉花虫草粗多糖进行了脱蛋白试验。结果表明:采用大孔树脂法或Sevag法均不能完全去除粗多糖中的游离蛋白,两种方法结合脱蛋白除杂效果较为理想,蛋白去除率达96%以上。初步分离获得大孔树脂水相洗脱部位和20%乙醇洗脱部位2种主要多糖组分。综合分析,先用Sevag法脱蛋白2～3次,再用大孔树脂AB-8吸附分离,或先大孔树脂AB-8吸附分离获得不同多糖组分,再用Sevag法辅助脱蛋白1～2次,两种方法去除蝉花虫草粗多糖中蛋白的效果均较好。

蝉虫草子实体与发酵菌丝体胞内多糖成分分析

比较蝉虫草子实体、孢梗束、虫体以及蝉虫草发酵菌丝体的胞内多糖含量、单糖组成和分子量差异,结果表明,蝉虫草子实体与发酵菌丝中胞内多糖的含量和组成均存在差异。葡萄糖、半乳糖和甘露糖是蝉虫草发酵菌丝体和子实体粗多糖中主要的3种单糖,阿拉伯糖和木糖是子实体粗多糖中的特征性单糖,而果糖属于菌丝体的特征性单糖。子实体粗多糖中高分子量组分(>1×106Da)的相对含量明显高于菌丝体粗多糖。本研究对提升蝉虫草发酵多糖产品品质、促进蝉虫草开发应用具有参考价值。

蝉花虫草酒免疫功能研究

本研究通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和二硝基氟苯诱导小鼠DTH实验、抗体生成细胞实验和血清溶血素实验、小鼠碳廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验及NK细胞活性测定实验分别研究了蝉花虫草酒对小鼠细胞免疫、体液免疫、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性的影响作用。结果表明,蝉花虫草酒低、高剂量组均无明显细胞免疫增强功能;高剂量组能提高小鼠的溶血空斑数和小鼠抗体积数,具有增强体液免疫功能;与阴性对照组比较,高剂量组能够明显提高小鼠的碳廓清吞噬指数和巨噬细胞吞噬鸡红细胞指数,具有增强单核巨噬细胞的功能;高、低剂量组无明显提高小鼠NK细胞活性的作用。根据上述实验结果和2003版《保健食品检验与评价技术规范》的规定判定蝉花虫草酒有增强机体免疫力的作用。

蝉花虫草人工培养条件的初步探究

利用人工培养得到蝉花虫草子实体,初步探究其培养条件,采用分光光度法测定其粗多糖和虫草酸含量,采用HPLC法测定虫草素含量。结果表明,当培养基中蝉蛹粉比例为25%、料液比为2.4时,蝉花虫草子实体干重最高,子实体中粗多糖、虫草酸、虫草素含量分别为110.0 mg·g^-1、38.62 mg·g^-1、0.323 2 mg·g^-1,均高于神农架野生蝉花虫草子实体的;与大别山野生蝉花虫草子实体相比,除粗多糖含量相对较低外,其它2种活性物质含量均较高,但都低于人工培养蛹虫草子实体。

蝉花虫草分类地位及其遗传多样性研究进展

蝉花虫草是我国一种传统的药食两用真菌,具有多种功效及药理作用,是一种十分具有开发价值的虫草真菌。随着近年分子系统学的研究,其分类地位发生了变更,主要从蝉花虫草的历史记载、分类地位变迁及其遗传多样性的研究对蝉花虫草进行了综述,为蝉花虫草的开发和利用提供参考。

浙江天目山蝉花虫草的分离及基质栽培

在浙江天目山竹林土壤感染的竹蝉若虫上分离获得了一株蝉花虫草TM06菌株,分析了TM06菌株ITS序列,采用小麦为基质建立了TM06菌株的基质栽培技术。结果表明,分离获得的TM06菌株与蝉花虫草亲缘关系最近,以小麦为基质可培养蝉花虫草TM06的子实体,添加5%的蝉蛹粉可显著提高子实体产量,每瓶子实体干重平均为11.61 g。

人工培育的蝉花子实体对H22荷瘤小鼠免疫功能影响的研究

目的:本试验主要研究人工培育的蝉花虫草子实体对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法:40只ICR小鼠在腋下通过皮下接种H22肝癌小鼠腹水建立荷瘤小鼠的模型,接瘤24 h后进行随机分组,模型组、蝉花虫草子实体低、中、高剂量组、环磷酰胺阳性对照组,每组8只小鼠,共40只。蝉花虫草子实体低、中、高剂量组的小鼠分别按照75、150、450 mg/kg体重的剂量灌服蝉花虫草子实体生理盐水混悬液,每天1次;阳性对照组的小鼠按照20 mg/kg体重的剂量隔天腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液。连续给药14 d后,测各组小鼠的瘤体积、瘤重、肿瘤抑制率、脾脏指数、胸腺指数、血清免疫球蛋白和细胞因子含量、脾T淋巴细胞增殖能力。结果:各剂量组小鼠的瘤体积和瘤重均极显著低于模型组(P 【0.01),四组小鼠的肿瘤抑制率分别为49.13%、55.72%、56.53%、62.59%;低、中剂量组小鼠脾脏指数和胸腺指数均高于模型组(P 【0.05),高剂量组小鼠胸腺指数高于模型组(P 【0.05),低剂量组OD值大于模型组(P 【0.05);中、高剂量组和阳性对照组小鼠血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNF-α含量均高于模型组(P【0.05)。结论:人工培育的蝉花虫草子实体通过调节小鼠的免疫功能抑制肿瘤的生长。