北京协和医院病理科首先开展蝎形探针扩增阻滞突变系统检测石蜡切片基因突变

北京协和医院病理科在国内首次引入蝎形探针扩增阻滞突变系统（scorpions amplification refractory mutation system,Scorpions ARMS）进行石蜡切片基因突变检测,并证实该项新技术较之传统恶性肿瘤石蜡切片的基因突变检测具有高敏感性和特异性，可为非小细胞肺癌与结直肠癌检测提供可靠依据，为临床医师制定有效的治疗方案提供指导。

ARMS技术联合Taqman探针检测100例非小细胞肺癌EGFR基因突变

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是决定表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)疗效最重要的预测因子,对EGFR基因突变进行检测,对指导患者个体化治疗具有重要意义。EGFR基因突变检测方法有很多,每种方法各有优缺点,本研究拟采用扩增阻滞突变系统(ampli cation refractory mutation system,ARMS)技术与Taqman探针相结合的方法,建立一种能快速、敏感及特异检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的方法。方法首先,应用Primer Premier5.0软件在EGFR基因E746_A750和L858R处设计ARMS引物及Taqman水解探针。然后,以包含E746_A750缺失和L858R点突变的质粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性以及特异性。最后,用所建立的ARMS-Taqman法检测100例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)临床标本。结果在无背景DNA干扰的情况下,ARMS-Taqman法检测灵敏度可达10copies。对于检测敏感性,在500copies/L野生型基因背景下,其敏感性达1%;在5,000copies/l野生型基因背景下,其敏感性高达0.1%-0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞DNA为研究对象,21L858R突变存在一定程度的非特异性扩增,但其最小Ct高达14.89,而19Del未见非特异性扩增。对100份临床标本进行检测,19Del21例,21L858R18例,总突变率为39.0%。结论我们所构建的ARMS-Taqman法是一种快速、简便以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法,值得在临床上进一步推广和验证。

PCR直接测序法与ARMS检测非小细胞肺癌EGFR基因突变

目的 比较PCR直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中EGFR基因突变的敏感性.方法 用直接测序发与ARMS法同时检测154例NSCLC中EGFR基因第18、19、20、21外显子的突变情况.结果 男性84例,女性70例,年龄33 ～ 86岁,手术切除标本71例、活检标本79例,其中鳞状细胞癌27例、腺癌121例、腺鳞癌2例;另4例为胸水.测序法32例突变（32/154,20.8％）,ARMS法52例突变（53/154,33.8％）.两种方法均检测到突变者29例,均无突变者99例,直接测序法检测到突变而ARMS法阴性者3例,反之23例,不一致率差异有显著性（P＜0.000 1）.结论 检测NSCLC中EGFR突变情况时,ARMS法较直接测序法操作步骤少,突变率高.

直接测序法与ARMS法检测甲状腺乳头状微小癌组织中BRAF基因突变的比较

目的:探讨直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions amplification refractory mutation system,scorpions ARMS法)检测甲状腺乳头状微小癌组织中(Papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)的鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因突变的特异性和敏感性。方法:采用直接测序法和ARMS法同时检测56例甲状腺乳头状微小癌患者组织中BRAF基因突变情况。结果:56例患者甲状腺癌组织中,直接测序法与ARMS法所检出BRAF基因突变阳性率分别为32.1%和82.9%,敏感度分别为39.1%和100%,前者均显著低于后者(P<0.01)。结论:检测甲状腺乳头状微小癌组织BRAF基因突变时ARMS方法较直接测序法具有更好的敏感性,癌组织小的标本BRAF基因突变检测更适合用ARMS法。

ARMS法在检测肺癌晚期患者肿瘤组织和血浆表皮生长因子受体基因突变中的应用

目的 应用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（ARMS-PCR）检测晚期肺癌患者血清游离DNA和肿瘤组织中表皮生长因子受体（EGFR）基因突变,探索两者间的一致性。方法 同时收集53例未经治疗的肺癌Ⅲb～Ⅳ期患者的原发灶肿瘤组织和外周血,分别提取DNA,采用ARMS-PCR扩增EGFR基因的第18、19、20和21外显子突变,对结果不一致的标本用微滴式数字PCR法对外周血标本进行验证。结果 血浆EGFR基因突变检测的灵敏度为51.4%（17/33）,特异度为100%;血浆EGFR基因的突变率为29.4%;16例血浆和组织结果不一致的标本,数字PCR检测的结果与血浆游离DNA检测的结果一致。结论 血浆游离DNA为监测Ⅲb～Ⅳ期肺癌患者原发肿瘤中EGFR基因突变提供了新的来源,ARMS法是检测血浆游离DNA中EGFR基因突变的可靠有效方法。

907例非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变特点及与临床特征的关系。方法收集907例NSCLC肿瘤组织,分别提取DNA,采用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应(ARMS-PCR)扩增EGFR基因29种突变。结果 907例NSCLC中,359例(39.6%)EGFR基因有突变,其中18、19、20、21外显子单独突变分别为6例(0.7%)、152例(16.8%)、8例(0.9%)、170例(18.7%),共见突变类型7种;热点突变类型为19外显子缺失(构成比42.3%)和21外显子L858R突变(构成比45.1%)。女性患者突变率高于男性患者(56.9%vs 25.7%,P<0.05),腺癌患者突变率高于鳞癌患者(49.0%vs 10.0%,P<0.05),未发现EGFR基因突变率与标本来源、年龄和肿瘤细胞比例相关。结论 NSCLC患者EGFR基因突变以19、21外显子突变为主,突变率以腺癌患者和女性较高。

Scorpions-ARMS法检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变及其临床预测价值的研究

目的应用蝎形扩增阻滞突变系统(Scorpions-ARMS)检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变及其临床预测价值的研究。方法应用蝎型扩增阻滞突变系统(Scorpions-ARMS)检测非小细胞肺癌外周血中EGFR基因第18、19、20及21外显子突变,统计分析EGFR基因突变的相关因素。结果 50例非小细胞肺癌患者中,EGFR基因的突变率为30%(15/50)。结果 EGFR基因的突变率47.4%(女性)明显高于19.4%(男性)。非吸烟患者EGFR突变率45.5%高于吸烟患者17.9%,差异有统计学意义(P=0.035)。在非小细胞肺癌患者中,腺癌患者EGFR突变率40.6%明显高于非腺癌患者11.1%,差异有统计学意义(P=0.029)。结论 Scorpions-ARMS是检测血清游离DNA中EGFR基因突变的可靠有效方法。

华北地区CYP1A2基因常见SNP位点的分布

目的建立CYP1A2基因-3860G>A、-3113G>A、-2467del T、-739T>G、-163C>A、2321G>C、5347C>T等7个SNP位点的检测方法,探讨7个SNP位点在华北地区人群中的分布。方法选取健康受试者,提取全血样本DNA,以Primer Premier 5软件自设计引物及探针,采用扩增阻滞突变系统(ARMS)结合Taq Man探针技术(ARMS-Taq Man法)建立CYP1A2基因7个SNP位点基因分型方法。结果 -3860G>A、-3113G>A、-2467del T、-739T>G、-163C>A、2321G>C、5347C>T7个SNP位点的突变等位基因频率分别为0.292、0.078、0.524、0.078、0.657、0.148、0.127。结论成功建立7个SNP位点的ARMS-Taq Man基因分型方法,该方法具有准确、操作简单、高通量等优势。

表皮生长因子受体基因突变临床检测方法学比较及其影响因素分析

目的 比较临床常用的两种方法检测晚期非小细胞肺癌（NSCLC）表皮生长因子受体（EGFR）基因突变状态结果的差异,探讨福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片标本的不同保存方式对DNA数量、质量及对检测结果的影响.方法 收集中国医学科学院肿瘤医院2010年11月至2011年8月晚期NSCLC FFPE组织切片标本150份,分别采用楔形探针扩增阻滞突变系统（ScorpionsARMS）和直接测序法检测EGFR第18、19、20、21号外显子突变状态,分析两种方法检测EGFR基因突变结果的差异,对结果不一致病例收集临床治疗情况及生存数据并进行分析.对其中30份FFPE标本提取DNA并保存于-20℃3年,同样的30份FFPE标本按常规方法保存3年后再提取DNA,比较两种保存方式对DNA的数量、质量及对检测结果的影响.结果 Scorpions ARMS法检测EGFR基因突变的成功率（100％）高于直接测序法（87.3％）,差异有统计学意义（χ^2=20.28,P＜0.05）.两种方法检测EGFR基因突变的一致率为84.7％,一致性较好（Kappa=0.738,P＜0.001）.分析结果不一致病例中5例接受靶向药物治疗后患者的生存情况,与ARMS检测结果一致性相对较好.新鲜FFPE标本提取并贮存于-20℃、3年的DNA与FFPE标本按常规方法保存3年后提取的DNA相比,后者质量相对较差,片段化程度更严重,但两种保存方法获取的DNA的EGFR基因突变检测结果均一致.结论 Scorpions ARMS与直接测序法联合检测结果更为全面、可靠.检测结果不确定的患者应以临床治疗及生存资料支持诊断.FFPE标本提取DNA后低温贮存,更有利于DNA完整性的保存.

外周血游离DNA检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变研究进展

外周血游离DNA检测非小细胞肺癌人群表皮生长因子受体基因突变法因受到标本质量、采集运输分离条件、DNA提取方法、基因突变检测方法的多种限制，检测敏感性低，假阴性比例较高，但特异性较好。因此，外周血游离DNA的基因突变检测需针对特殊人群，优化采集运输分离步骤，并尝试使用较好的DNA提取（如改良酚一氯仿法、QIAmpCirculatingNucleicAcidKit）及基因检测方法（如蝎形探针扩增阻滞突变系统、高效液相色谱法、高分辨溶解曲线分析技术、突变一富集PCR等）。本文就外周血游离DNA表皮生长因子受体基因突变检测的现状及发展方向进行综述。

非小细胞肺癌患者血浆EGFR基因突变的检测

目的应用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应(ARMS-PCR)检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆游离DNA中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变情况。方法收集本院182例非小细胞肺癌晚期患者的外周血,分别提取循环DNA,采用ARMS-PCR扩增EGFR基因的第18、19、20和2l外显子突变,并将部分病例结果与同时期组织或胸水检测结果进行比较分析。结果血浆EGFR基因的突变率为28.0%,主要以19-del突变为主,构成比占56.9%;腺癌患者突变率高于鳞癌患者,差异有统计学意义(32.7%vs.6.7%,P<0.05),未发现血浆EGFR基因突变率与性别、年龄、病理分期和分化程度相关;64例血浆与组织检查结果比对一致率为71.9%,16例血浆与胸水检查结果比对一致率为75.0%,血浆与组织和胸水的检测结果比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论晚期非小细胞肺癌患者血浆EGFR基因的突变率比肿瘤组织和胸水标本低,肿瘤组织仍是最佳的检测标本,实在难以获取肿瘤组织时血浆标本是有效的补充。