表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性

经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。

蝎毒对人肝癌细胞Bel-7404凋亡及端粒酶逆转录酶基因的作用

目的观察蝎毒对人肝癌Bel-7404细胞增殖的影响及对端粒酶逆转录酶基因(hTERTmRNA)活性的影响。方法以人肝癌细胞株Bel-7404为研究对象,以不同浓度的蝎毒处理体外培养的人肝癌Bel-7404细胞72 h,以噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制,采用RT-PCR法检测细胞hTERTmRNA的表达情况。结果MTT结果显示蝎毒抑制Bel-7404细胞增殖、诱导细胞凋亡且抑制有浓度依赖性。同时,蝎毒可抑制hTERTmRNA的表达。结论抑制端粒酶逆转录酶基因(hTERTmRNA)表达而抑制端粒酶的活性、诱导细胞凋亡,可能是蝎毒的抗癌细胞机制之一。

基因重组核型多角体病毒AcMNPV-AaIT对甜菜夜蛾幼虫的毒力研究

研究了基因重组核型多角体病毒AcMNPV AaIT和野生型多角体病毒AcMNPV C6对甜菜夜蛾的病原性,并添加感染增效物质,研究其增效作用。结果表明:AcMNPV AaIT对甜菜夜蛾3、4龄幼虫的LD50分别为151、379PIB/头,比AcMNPV C6少39、906PIB/头;LT50分别比AcMNPV C6缩短1.1d和1.5d;昆虫病毒感染增效物质具有强烈的感染增效作用,增效比值为617倍。

蝎毒对Hela细胞p21基因表达的影响

采用RT-PCR和Western-blot方法分别检测蝎毒对Hela细胞p21基因的mRNA和蛋白表达,研究蝎毒抗癌作用的分子机理。结果表明:经不同质量浓度(50,100,200μg/m L)蝎毒处理的与未经蝎毒处理的Hela细胞p21基因在mRNA水平表达相近,而在蛋白表达水平上,经蝎毒处理的与未经蝎毒处理的细胞相比,p21基因表达均有明显增强,并以经100μg/m L蝎毒处理的Hela细胞p21基因的蛋白表达增强最为明显,由此证明蝎毒抑制Hela细胞增殖的机理可能是增强了p21基因的蛋白表达。

双价抗虫基因植物表达载体的构建

将蝎毒基因BmKITS和几丁质酶基因chitinase2个抗虫基因采用不同的启动子ubi或35S,连到2个高效的植物表达载体pWM101和pBI101中,2个重组表达质粒分别经过限制性酶切分析和PCR鉴定,实验结果表明2个含有双价抗虫基因的植物重组表达质粒均已构建成功.

重组棉铃虫病毒的外源基因向其他生物的转移

本文报道了基因工程棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV-AaIT)的外源蝎子毒素基因(AaIT)是否会向环境中的植物病原微生物或捕食性天敌转移的实验结果。首先,于实验室内将重组病毒HaSNPV-AaIT与棉花黄萎病病菌(VerticilliumdahliaeLleb.)进行了长达90d的混合培养,在混合培养30d,60d和90d后分别提取棉花黄萎病病菌的基因组DNA,用AaIT基因作探针进行点杂交,结果显示无阳性信号。另外,从多次施用过重组病毒的棉花田中采集了120只龟纹瓢虫和七星瓢虫,利用健康蚜虫饲养3-4d,用碱解液处理瓢虫体表后,从处理液中可以检测到病毒DNA;但瓢虫体表经碱解液和Dnase处理后,从瓢虫体内提取的基因组DNA,用PCR和斑点杂交的方法,都没有检测到AaIT的序列存在。本研究的实验结果说明,基因工程病毒的外源基因向其它生物转移的可能性极低。

蝎毒对白血病HL-60细胞生长的抑制和诱导凋亡作用研究

目的 :研究蝎毒对HL 60细胞的生长抑制和诱导凋亡作用 ,并探讨其作用机制。方法 :应用MTT法观察蝎毒对细胞的抑制作用 ,光镜、荧光显微镜和透射电镜观察细胞结构的改变 ,原位末端标记检测DNA断裂 ,流式细胞术分析凋亡细胞和bcl 2蛋白表达。结果 :蝎毒可明显地抑制HL 60细胞生长和诱导细胞凋亡 ,作用在一定范围内呈对浓度和时间的依赖性 ,蝎毒并能下调HL 60细胞bcl 2蛋白表达。结论 :蝎毒能抑制HL 60细胞生长和诱导细胞凋亡 ,其作用机制可能与bcl 2蛋白表达的下降有关。

蝎毒多肽提取物对人膀胱癌T24细胞增殖抑制作用的研究

目的探讨蝎毒多肽提取物(PESV)对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用及其机制。方法采用体外培养法培养T24细胞,应用MTT法检测对照组和实验组(不同浓度PESV)处理膀胱癌T24细胞后的增殖变化;倒置显微镜观察其对T24细胞形态的影响;RT-PCR检测实验组(低剂量、中剂量及高剂量)BAX和Bcl-2的mRNA的表达变化。结果:PESV能显著抑制T24细胞的增殖,呈现时间和剂量依赖性,差异具有统计学意义(P<0.01),24h抑制率接近50%的T24细胞生长浓度为75mg/L;低、中及高浓度PESV均可致T24细胞生长明显抑制,出现典型细胞凋亡形态;和对照组比较,实验组BAXmRNA和BAX/Bcl-2mRNA表达升高,Bcl-2mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PESV对膀胱癌T24细胞具有明显抑制作用,其诱导T24细胞凋亡的作用可能与上调BAX和下调Bcl-2的表达有关。

蝎毒联合眼镜蛇毒体外抗胃癌细胞BGC-803及作用机制的研究

目的:探讨蝎毒(scorpid poison)与眼镜蛇毒(cobra venom)联合应用对胃癌细胞BGC-803凋亡的影响及作用机制。方法:用蝎毒和(或)眼镜蛇毒处理体外传代培养的胃癌细胞株BGC-803。荧光显微镜下观察细胞增殖变化、进行活细胞计数及计算细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR观察凋亡相关基因Bcl-2表达的变化。结果:蝎毒与眼镜蛇毒联合应用相对于单用蝎毒或眼镜蛇毒可显著提高胃癌细胞凋亡率、抗凋亡基因Bcl-2表达明显下降(P<0.05)。随着蝎毒和眼镜蛇毒合用浓度的增高,胃癌细胞凋亡率增加、抗凋亡基因Bcl-2表达下降更明显(P<0.05)。同一药物浓度作用24h与48h相比,亦有明显差异(P<0.05)。结论:蝎毒与眼镜蛇毒联合应用具有协同抗胃癌细胞的作用,并具有浓度和时间依赖性,其机制可能与增强诱导胃癌细胞凋亡及调控凋亡相关基因Bcl-2的表达有关。

基于基因芯片蝎毒多肽提取物对H22肝癌抑制作用的研究

目的:通过表达谱基因芯片研究蝎毒多肽提取物PESV对H22肝癌基因表达的影响,探讨其可能的药物作用机理。方法:建立H22肝癌皮下荷瘤模型,将60只昆明小鼠随机分为模型组、PESV组、Gemcitabine和TNP-40组,每组15只;无菌摘取皮下肿瘤组织,提取总RNA,通过反转录方法制备cDNA荧光探针,进行芯片杂交,然后对芯片进行图像扫描,最后用Imagene4.0软件包对荧光信号进行分析。结果:蝎毒多肽提取物PESV作用于荷瘤小鼠后,有127个基因表达下调,433个基因表达明显上调,其中35个基因与抗肿瘤血管生成药物TNP-470处理组下调基因一致,有40个与化疗药物Gemcitabine处理组下调基因一致。结论:蝎毒多肽提取物PESV可能同时具有细胞毒作用和抗血管生成作用双重作用,有望成为一种极具前景的肿瘤治疗药物。

球孢白僵菌工程菌株构建及其环境安全性分析

以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb202作为出发菌株,同时引入外源毒力基因,即北非蝎(Androctonus australis)昆虫特异性神经毒素多肽基因AaIT(GI:69545),构建高毒力的工程菌株Bb202T-7,并用SPSS软件统计分析,结果显示,Bb202T-7对松墨天牛(Monochamus alternatus)的杀虫效率提高了11.11%。研究目的是为生物防治提供性能良好的出发菌株,为高效杀虫剂的研制提供基础资源,克服真菌杀虫剂击倒昆虫所需时间长,对环境条件要求高等缺点,加速真菌杀虫剂的产业化步伐。同时对基因工程重组菌株的安全性问题进行分析,并提出解决方案。

蝎毒对白血病Raji细胞株的生长抑制和诱导凋亡作用的研究

目的 :采用人类 B淋巴细胞株 Raji细胞作为实验模型 ,用东亚钳蝎毒 (BMK)作为干预手段 ,观察其对Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用 ,并探讨其作用机制。方法 :MTT法 ,Wright- Gimesa染色法 ,Hoechst3334 2和 PI荧光染色 ,透射电镜技术和流式细胞分光光度术。结果 :BMK(12 .5 m g/ L～ 2 0 0 .0 mg/ L)可明显地抑制 Raji细胞生长和诱导细胞凋亡 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1) ,并且其作用强度在一定范围内呈现对浓度和时间的依赖性。流式细胞仪分析显示BMK能下调 Raji细胞 bcl- 2蛋白表达。结论 :BMK能抑制 Raji细胞生长和诱导细胞凋亡 ,其作用机制可能与 bcl- 2蛋白表达的下降有关。

蝎毒多肽对白血病细胞株KG1a干细胞活性的影响

目的:探讨蝎毒多肽对白血病细胞株KG1a干细胞活性的影响。方法:免疫磁珠法分离出CD34+CD38-的KG1a细胞,按照不同给药方式分空白组、PESV组、DNR组、PESV+DNR组,培养后经WST-8、流式细胞仪分别检测KG1a干细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和细胞周期,并经RT-PCR检测PTEN基因、Tie-2基因mRNA表达。结果:KG1a干细胞在PESV组、DNR组细胞增殖抑制率(%)与空白组相比差异有统计学意义(P<0.05)。诱导细胞凋亡作用强弱:PESV+DNR组>DNR组>PESV组。细胞周期检测结果显示,G0/G1期PESV+DNR组与PESV组、DNR组相比差异有统计学意义(P<0.01)。在G2/M期PESV+DNR组与PESV组、DNR组相比差异有统计学意义(P<0.05)。PESV组、DNR组、PESV+DNR组KG1a干细胞的PTEN基因、tie-2基因表达均上调,PESV+DNR组为高表达。结论:PESV能够抑制KG1a干细胞增殖,但不能增强DNR的抑制作用;PESV对DNR损伤KG1a干细胞有诱导凋亡和分化的作用,其机制可能与上调KG1a干细胞的PTEN基因、tie-2基因表达有关。

毕赤酵母Muts与Mut＋重组子表达蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1水平比较

蝎毒镇痛活性肽Bm K Ang M1是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离得到的一种新型长链蝎毒素,其镇痛活性强且毒性低,有望开发成镇痛新药。本文将Bm K Ang M1基因转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到甲醇利用缓慢型(Muts)和快速型(Mut+)的重组子;采用实时荧光定量PCR方法,检测了Mut+重组子中Bm K Ang M1基因的拷贝数,筛选出含单拷贝Bm K Ang M1基因的Mut+重组子;在相同培养条件下,比较了含单拷贝Bm K Ang M1基因的Muts和Mut+重组子表达Bm K Ang M1的水平。结果表明,Muts重组子中Bm K Ang M1基因转录水平是Mut+重组子的2.7倍,Muts重组子中Bm K Ang M1蛋白表达量是Mut+重组子的1.5倍。因此,Muts重组子比Mut+重组子具有更强的Bm K Ang M1表达能力。

P-gp、bcl-2蛋白表达在人红白血病多药耐药现象中的意义

目的 :探讨 P- gp、bcl- 2蛋白在人红白血病多药耐药中的作用。方法 :用 MTT法、原位末端转移酶标记法、流式细胞术等分别对蝎毒诱导人红白血病耐药细胞株 (K5 6 2 / ADM)及敏感细胞株 (K5 6 2 )凋亡及其 P- gp、bcl- 2蛋白表达进行研究。结果 :蝎毒可明显抑制 K5 6 2及 K5 6 2 / ADM细胞生长和诱导细胞凋亡 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1) ,其作用强度在一定范围内呈现对浓度的依赖性 ;耐药细胞株中 P- gp、bcl- 2蛋白表达明显强于敏感细胞株 ;蝎毒可抑制 K5 6 2 / ADM细胞中 P- gp、bcl- 2蛋白表达。结论 :凋亡抑制基因 bcl- 2编码蛋白的过度表达可能是人红白血病多药耐药细胞凋亡耐受的分子基础 ,细胞凋亡与肿瘤细胞的耐药密切相关。

重组中国棉铃虫病毒杀虫剂

重组中国棉铃虫病毒杀虫剂是将蝎毒基因插入棉铃虫病毒基因，而成功构建的一种含有缺失egt基因的病毒杀虫剂。该杀虫剂具有对人畜无毒害，对环境无污染等特点，克服了野生病毒杀虫速度慢、作物损耗量大等缺点，在室内和田间应用显示出很好的改良效果。