基于PI3K/Akt信号通路探索黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽对前列腺癌细胞增殖、迁移及自噬的作用机制

目的:探索黄芪甲苷IV和蝎毒多肽对前列腺癌细胞活性、迁移、凋亡、周期、自噬及对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。方法:将人前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3随机分为空白对照组、黄芪甲苷IV组、蝎毒多肽组,黄芪甲苷IV-蝎毒多肽组,雷帕霉素(阳性药物组)组,各组给予对应的药物处理24 h后,取对数生长期的肿瘤细胞进行检测。采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)、Transwell试剂盒、凋亡试剂盒、细胞周期检测试剂盒、免疫荧光分析检测各组前列腺癌细胞活性、迁移能力及对细胞凋亡、周期、自噬靶点LC3的影响。Western印迹法用于检测p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Beclin1、LC3、P62的蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,黄芪甲苷IV-蝎毒多肽组前列腺癌细胞活性降低(P<0.05)、细胞穿模数(迁移能力)减少(P<0.05);前列腺癌细胞早期凋亡率(LR)、晚期凋亡率(UR)及总凋亡率均增高(P<0.05);G1期细胞占比增高(P<0.05)、G2+S期占比降低(P<0.05);LC3免疫荧光表达量显著增加(P<0.05);上调了前列腺癌细胞LNCaP、PC-3中LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达(P<0.05);下调了P62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白的表达(P<0.05)。且黄芪甲苷IV-蝎毒多肽在抑制前列腺癌细胞活性及迁移能力、抑制细胞有丝分裂、促进细胞早期凋亡及上调LC3表达水平、抑制PI3K/AKT通路和促进自噬靶点优于单独黄芪甲苷IV组或蝎毒多肽组(P<0.05)。结论:黄芪甲苷IV-蝎毒多肽抑制前列腺癌细胞增殖迁移、抑制细胞有丝分裂、促进细胞早期凋亡及促进自噬的机制可能与抑制PI3K/AKT通路有关。

蝎毒多肽优化体CT-K3K7抗食管癌的机制研究

目的探讨蝎毒多肽优化体CT-K3K7对食管癌细胞的作用及机制。方法采用CCK-8法检测蝎毒多肽优化体CT-K3K7对食管癌细胞KYSE70与KYSE150增殖的影响;克隆形成实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150克隆形成的影响;划痕实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞迁移能力的影响;PI吸收实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150的细胞膜完整性的影响;流式细胞术检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞线粒体膜电位、ROS水平及凋亡率的影响;Western blot检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞中3种凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达水平的影响。结果蝎毒多肽优化体CT-K3K7作用后,食管癌细胞KYSE70与KYSE150的增殖与迁移能力受到抑制;细胞膜通透性增强;细胞内线粒体膜电位降低、ROS富集且细胞凋亡率明显升高;抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达量随着CT-K3K7作用浓度的升高显著下调,而促凋亡蛋白Bax和凋亡效应蛋白Caspase-3表达量则随着CTK3K7的作用浓度升高显著上调。结论CT-K3K7能显著抑制食管癌细胞的增殖和迁移,其机制可能是通过破坏细胞膜直接杀伤食管癌细胞,还可能通过影响食管癌细胞线粒体功能从而诱导细胞凋亡。

蝎毒多肽的镇痛及抗炎作用

采用热板法和醋酸扭体法证明腹腔注射蝎毒多肽０．６５０，０．４３３ｍｇ／ｋｇ能明显升高小鼠痛阈和减少小鼠的扭体次数．腹腔注射蝎毒多肽０．４３３，０．２１６ｍｇ／ｋｇ能明显对抗蛋清所致的大鼠足肿胀；连续７天腹腔注射蝎毒多肽０．２６０，０．１３０ｍｇ／ｋｇ能明显抑制大鼠棉球肉芽肿形成；腹腔注射蝎毒多肽０．６５０，０．

东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响及其诱导凋亡的初步机制。方法:将人肝癌细胞株Hep G2浸润在不同浓度的蝎毒多肽组分Ⅲ溶液中,应用DNA凋亡梯状带分析法和DNA末端转移酶介导的末端标记法(TUNEL法)测定凋亡的发生及凋亡率;用Western blotting方法观察Bcl-2蛋白和Caspase-3的表达量。结果:蝎毒多肽组分Ⅲ引起的肝癌细胞株Hep G2凋亡呈剂量依赖性变化。DNA凋亡呈现明显的梯状带电泳行为。经5、10、50、100及200 mg.L-1蝎毒多肽组分Ⅲ处理12 h后,肝癌细胞凋亡率分别为(6.1±3.0)%、(15.3±4.9)%、(48.5±5.2)%、(66.7±6.5)%和(91.2±6.9)%。凋亡伴随着bcl-2基因的表达下调,在凋亡过程中Caspase-3被激活。结论:东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ可以促进人肝癌细胞株Hep G2的凋亡,并且这种凋亡可能与通过下调bcl-2基因和激活Caspase-3途径有关。

蝎毒多肽提取物抑制DU-145细胞COX-2和MMP-9表达的研究

目的:研究蝎毒多肽提取物(peptide extract from scorpion venom,PESV)对雄激素非依赖性人前列腺癌细胞株DU-145COX-2和MMP-9表达的影响,进一步探讨其抗血管生成的分子机制,为抗前列腺癌骨转移提供有效的治疗手段。方法:采用免疫组只化学方法检测PESV对COX-2、MMP-9蛋白表达的影响,应用RT-PCR检测PESV对MMP-9在mRNA水平表达的影响。结果:蝎毒多肽提取物(40μg/mL)作用于前列腺癌细胞后,COX-2、MMP-9蛋白表达水平明显下调(P<0.05),进一步检测发现MMP-9在mRNA水平亦明显下降(P<0.05)。结论:蝎毒多肽提取物(PESV)通过抑制前列腺癌细胞血管生成因子COX-2的表达而发挥其抗血管生成作用,具有临床应用价值。

蝎毒多肽提取物对白血病小鼠Bcl-2 SDF-1α与TGF-β1表达的影响

目的:探讨蝎毒多肽提取物(PESV)对白血病小鼠Bcl-2、SDF-1α与TGF-β1表达的影响,探究PESV对白血病细胞增殖和浸润的影响与机制。方法:NOD-SCID小鼠60只,按本课题前期研究方法,建立人白血病NOD-SCID小鼠髓外浸润模型。选取造模成功的小鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别为高、中、低剂量组和模型组,另设同周龄正常NOD-SCID小鼠10只为空白对照组。高、中、低剂量组每只分别尾静脉注射PESV 1.2mg/(kg·d)、0.6mg/(kg·d)、0.3mg/(kg·d),模型组和空白组每只均尾静脉注射0.9%的生理盐水0.3mL/d,35d后全部处死,取血清和骨髓细胞培养液上清,用ELISA法进行Bcl-2、SDF-1α与TGF-β1的检测。结果:高、中、低剂量组存活率均高于模型组,高、中、低剂量组小鼠血清以及骨髓的Bcl-2、SDF-1α均明显低于模型组(P<0.05),而TGF-β1均高于模型组,均以高剂量组效果最为明显(P<0.05)。结论:蝎毒多肽提取物可以有效的降低白血病小鼠血清及骨髓中Bcl-2、SDF-1α的表达,提高TGF-β1的表达,具有较好的阻抑白血病细胞增殖和浸润的作用。

蝎毒多肽提取物对白血病细胞株K562/A02荷瘤鼠耐药性的影响

目的探讨蝎毒多肽(peptide extract from scorpion venom,PESV)逆转白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)在体内多药耐药(multidrug resistance,MDR)的分子机制。方法以多药耐药的K562/A02细胞株成模白血病BALB/c裸鼠为例,成模鼠随机分为6组:模型对照组、阿霉素(ADM)组、PESV组、ADM+PESV(H)组、ADM+PESV(M)组、ADM+PESV(L)组。模型对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液腹腔注射,其余各组予相应剂量ADM和(或)PESV腹腔注射,连续给药14天。第21天观察各组裸鼠移植瘤生长情况,分别检测瘤块中LSC:细胞膜上P-gp的表达,细胞质中ALDH、PI3K的变化及细胞核中MDR1、NF-κB的活性。结果 K562/A02细胞经免疫磁珠分选前后的CD34+CD38-细胞比率和IC50值分别为31.5%、(60.33±10.68)μg/ml和92.8%、(58.33±9.72)μg/ml,分选后细胞干性显著提高,而耐药性无差异性损失;各组造模裸鼠成瘤率100%。瘤体中LSC:流式细胞仪检测细胞膜上P-gp表达结果:检测对照组89.8%、ADM组91.9%、PESV组88.4%、ADM+PESV(H)组53.9%、ADM+PESV(M)组78.0%、ADM+PESV(L)组78.7%;半定量RT-PCR检测MDR1 m RNA的表达:PESV组>ADM+PESV(L)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(H)组>ADM组;免疫组织化学检测ALDH,显示灰度值ADM组>PESV组>ADM+PESV(H)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(L)组;Western blot检测PI3K分子与Elisa检测NF-κB因子结果一致,在ADM组、PESV组表达上调,在ADM+PESV组中表达下调,下调强度与PESV剂量呈正相关。结论 PESV具有下调白血病干细胞膜上P-gp,细胞质内ALDH、PI3K及细胞核中MDR1、NF-κB的表达水平,增强了白血病K562/A02干细胞在体内对ADM的敏感度,逆转其多药耐药特性。

蝎毒多肽提取物对白血病小鼠E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响

目的探讨蝎毒多肽提取物(PESV)对E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响,探究PESV对白血病细胞髓外浸润的影响与机制。方法NOD-SCID小鼠50只,建立人白血病NOD-SCID小鼠髓外浸润模型,随机分为5组,每组10只,分别为PESV高、中、低剂量组,模型组和空白组。PESV高、中、低剂量组小鼠分别尾静脉注射PESV1.2,0.6,0.3 mg/kg,模型组和空白组均注射0.9%的生理盐水0.3 ml,治疗28 d后,用流式细胞术检测小鼠外周血中CD49d和CXCR4的表达,35 d处死小鼠后用免疫组化法检测其肝脏中E-钙黏蛋白表达。结果治疗组CD49d和CXCR4的表达均低于模型组(P<0.01),各治疗组E-钙黏蛋白表达均高于模型组(P<0.01)。结论PESV可以有效地提高白血病小鼠E-钙黏蛋白的表达,降低CD49d和CXCR4的表达,具有较好的阻抑白血病细胞髓外浸润的作用。

蝎毒多肽提取物对人膀胱癌T24细胞增殖抑制作用的研究

目的探讨蝎毒多肽提取物(PESV)对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用及其机制。方法采用体外培养法培养T24细胞,应用MTT法检测对照组和实验组(不同浓度PESV)处理膀胱癌T24细胞后的增殖变化;倒置显微镜观察其对T24细胞形态的影响;RT-PCR检测实验组(低剂量、中剂量及高剂量)BAX和Bcl-2的mRNA的表达变化。结果:PESV能显著抑制T24细胞的增殖,呈现时间和剂量依赖性,差异具有统计学意义(P<0.01),24h抑制率接近50%的T24细胞生长浓度为75mg/L;低、中及高浓度PESV均可致T24细胞生长明显抑制,出现典型细胞凋亡形态;和对照组比较,实验组BAXmRNA和BAX/Bcl-2mRNA表达升高,Bcl-2mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PESV对膀胱癌T24细胞具有明显抑制作用,其诱导T24细胞凋亡的作用可能与上调BAX和下调Bcl-2的表达有关。

蝎毒多肽提取物促进环磷酰胺抑制Lewis肺癌的作用机制研究

目的探讨蝎毒多肽提取物增强环磷酰胺抗肿瘤的机制。方法建立小鼠Lewis肺癌皮下荷瘤模型,随机分为荷瘤对照组(模型组)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)组、蝎毒多肽提取物(polypeptideextract from scorpion venom,PESV)组和联合组(CTX+PESV组),每组10只。记录肿瘤生长曲线,并采用逆转录PCR法和免疫组织化学法检测肿瘤微环境中免疫抑制因子血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达变化,采用免疫荧光化学法检测肿瘤组织中树突细胞(dendritic cells,DCs)表型CD80、CD86的表达变化。结果连续治疗21天后,联合组Lewis肺癌移植瘤的生长明显抑制(P<0.05);与模型组相比较,PESV组中CD80、CD86的表达有所增强,而CTX组中CD80、CD86的表达有所下降,联合组与CTX组相比强度和表达量均有所增加;与模型组比较PESV组和CTX组TGF-β1和VEGF-A mRNA表达量均降低(均P<0.05);与PESV组和CTX组比较,联合组TGF-β1和VEGF-A的mRNA表达量均降低(P<0.05)。结论 PESV可抑制Lewis肺癌中VEGF-A和TGF-β1的表达,促进DC的成熟,恢复其抗原摄取提呈功能,逆转CTX对机体的免疫损伤,从而起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

蝎毒多肽干预白血病细胞浸润效应及分子机制

白血病经化疗、放疗及骨髓移植等手段仍然不能治愈的主要原因之一是白血病细胞浸润，急性白血病，尤其是伴有粒单分化的髓系细胞或T淋巴细胞常常并发髓外组织浸润。随着科技进步，急性白血病治疗缓解率得到提高，但缓解后，髓外浸润组织的白血病细胞可能再次播散造成复发。本课题即是对中药全蝎提取物蝎毒多肽（PESV）干预白血病细胞浸润效应及分子机制进行了深入研究。

蝎毒多肽提取物对白血病细胞粘附力影响的实验研究

目的观察蝎毒多肽提取物(PESV,防治白血病中药提取物)对抑制人白血病原代细胞粘附力的影响。方法以人白血病原代细胞为研究对象,台盼蓝拒染法检测PESV对人白血病原代细胞的细胞毒作用;观察其对白血病原代细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附的影响。结果PESV在对细胞最佳作用浓度15μg.mL-1下,能够明显抑制人白血病原代细胞与HU-VEC的粘附,抑制率为(52.18±21.01)%;各浓度组与阳性对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。结论PESV在对细胞最佳作用浓度下,对人白血病原代细胞的黏附力有明显抑制作用。

蝎毒多肽提取物对K562细胞PI3K和p-Akt信号蛋白表达及细胞增殖的影响

本研究旨在探讨蝎毒多肽提取物(PESV)对人慢性髓系白血病细胞系K562细胞凋亡调控的PI3K和p-Akt信号蛋白的影响及作用机制。将体外培养的K562细胞,经PESV处理不同时间后,通过MTT法检测细胞增殖曲线,Western blot法检测PI3K及p-Akt蛋白水平变化。结果表明,与对照组相比,PESV处理后K562细胞凋亡率增加,PI3K及p-Akt蛋白表达降低。结论:PESV可能通过抑制凋亡调控的PI3K、p-Akt信号蛋白,抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡。

蝎毒多肽提取物对肺癌荷瘤裸鼠血流变学的影响

目的观察蝎毒多肽提取物(PESV)对肺癌荷瘤裸鼠血流变学的影响。方法移植肺癌荷瘤裸鼠随机分为PESV组(皮下注射PESV)与对照组(皮下注射生理盐水)。采用FA SCO-300型全自动表观黏度快测仪对两组的全血黏度进行检测。结果与对照组相比,PESV组血流变学指标均有不同程度的降低,尤其是全血低切表观黏度、全血高切表观黏度、C asson黏度、C asson屈服应力均明显低于对照组(P<0.01)。结论PESV可降低荷瘤裸鼠血液黏度,对肺癌荷瘤裸鼠肿瘤转移能力有明显的抑制作用。

蝎毒多肽对白血病干细胞MDR1mRNA和P-gp表达的影响

目的:探讨蝎毒多肽(PESV)对多药耐药白血病干细胞MDR1 mRNA和P-gp表达的影响。方法:以K562/A02细胞株为例,免疫磁珠法分选对数生长期细胞后经CCK-8法确认其耐药性,将耐药的K562/A02干细胞接种于BABL/c裸鼠右腋下形成瘤块,再将瘤块皮下包埋建立耐药性稳定的白血病模型。成模裸鼠随机分为6组:模型对照组、ADM组、PESV组、ADM+高剂量PESV组(高剂量组)、ADM+中剂量PESV组(中剂量组)和ADM+低剂量PESV组(低剂量组)。模型对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液腹腔注射,其余组予相应剂量ADM和(或)PESV腹腔注射,连续给药14天。第21天观察各组裸鼠移植瘤生长情况,流式细胞术检测各组瘤组织P-gp表达,RT-PCR法检测各组瘤组织MDR-1 mRNA表达水平。结果:K562/A02细胞经免疫磁珠分选前后的CD34+CD38-细胞比率和耐药率分别为31.5%、(60.33±10.68)μg/m L,92.8%、(58.33±9.72)μg/m L,分选后细胞干性显著提高,而耐药性无差异性损失。各组造模小鼠成瘤率100%,P-gp表达结果显示模型对照组89.8%、ADM组91.9%、PESV组88.4%、高剂量组53.9%、中剂量组78.0%、低剂量组78.7%,PESV+ADM下调P-gp表达,并与PESV呈现浓度依赖关系。MDR1mRNA的表达量PESV组>低剂量组>高剂量组>中剂量组>ADM组,其中PESV组、中剂量组、低剂量组高表达,P-gp表达与MDR1 mRNA水平具有一定的一致性。结论:PESV降低ADM作用K562/A02干细胞耐药性的强度,并与PESV剂量呈现正相关,其机制可能为PESV通过调控P-gp和MDR-1 mRNA的表达,增强了K562/A02干细胞对ADM的敏感度。

蝎毒多肽促进创伤皮肤溃疡愈合的实验研究

目的研究蝎毒多肽促进皮肤溃疡愈合的作用及其机制。方法 NIH小鼠60只,采用创伤溃疡模型,分成五组,分别为外用无菌生理盐水组(空白组)、外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,贝复济)组(150 AU/cm2)、蝎毒多肽高、中、低浓度治疗组(4×10-3、4×10-4、4×10-5mg/mL),给药的3、5、7、9 d测量创面面积,计算溃疡愈合率;采用液体试管法和琼脂稀释法观察体外抑菌作用。结果随给药时间延长,蝎毒多肽治疗组溃疡愈合率逐渐升高,与空白组比较,差异有统计学意义;蝎毒多肽对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.125 0 mg/mL。结论蝎毒多肽具有促进皮肤溃疡愈合及体外抑菌的作用。

蝎毒多肽对鸡胚血管生长的抑制作用

目的:探讨从东亚钳蝎蝎毒中分离的蝎毒多肽(STP)对血管形成的抑制作用。方法:采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的新生微血管模拟肿瘤的新生血管,用玻璃纤维滤纸吸附生理盐水和0.8μg、0.5μg的STP作为移植片,分别置入各组鸡胚的CAM上,孵化48h后,观察STP对CAM新生血管形成的影响。结果:0.5μgSTP实验组微血管密度及母血管的扩张均明显低于生理盐水组(P<0.01),表明STP能明显抑制CAM的新生血管的生长。结论:提示小剂量蝎毒多肽是一种有效的天然新生血管形成阻断剂。

蝎毒多肽抑制白血病干细胞龛内活化的实验研究

[目的]观察蝎毒多肽(PESV)抑制白血病干细胞(LSC)在骨髓龛内的活化效应。[方法]分离白血病/急性淋巴细胞白血病(AML/ALL)患者LSC,置于Transwell小室中,分为高中低剂量组及对照组,分别加入不同浓度蝎毒多肽后培养,计算不同浓度组及不同时间段的LSC迁移率。[结果]PESV组迁移率分别为(25.01±6.83)%、(36.85±3.83)%、(50.73±7.15)%,与对照组(49.10±6.12)%比较差异具有显著性(P<0.05),高剂量组迁移率高于中低剂量组。[结论]不同浓度PESV均有抑制白血病干细胞活化作用,抑制强度呈浓度依赖。

蝎毒多肽提取物对前列腺癌细胞增殖的影响

目的观察蝎毒多肽提取物（PESV）对非激素依赖性前列腺癌DU-145和PC-3细胞的生长与增殖、细胞周期及cyclinE和p27蛋白表达的影响。方法采用噻唑蓝（MTT）法检测PESV对前列腺癌细胞PC-3和DU—145生长与增殖的影响，流式细胞术观察药物对细胞周期的影响，免疫组织化学法检测药物干预后，cyclinE和p27蛋白水平表达的变化。结果MTT显示，PBSV在浓度40-200μg／ml时对前列腺癌细胞毒性作用明显（40μg／ml时，DU—145细胞抑制率为30．5％，PC-3细胞抑制率为33．1％，与阴性对照组相比，P〈0．05），且随剂量加大作用增大，浓度在200μg／ml时，100％抑制，呈明显剂量效应关系；流式细胞术显示，PESV干预后G0／G1细胞的百分比增多，S期的前列腺癌细胞减少（DU-145细胞和PC-3细胞S期的比例分别为34．1％和17．1％，与阴性组比较，P〈0．01）；免疫组化显示，PBMV干预后，DU-145和PC-3细胞cyclinE蛋白表达水平下调，p27蛋白表达水平上调。结论PESV对前列腺癌细胞增殖具有抑制作用。对前列腺癌治疗具有潜在价值。

蝎毒多肽对慢性粒细胞白血病细胞Hh通路下游活化因子Gli1表达的影响

目的探讨蝎毒多肽对慢性粒细胞白血病细胞Hedgehog通路(Hh通路)下游活化因子Gli1表达的影响。方法将慢性粒细胞白血病细胞K562接种于24孔板,随机分为蝎毒多肽1、2、3组和伊马替尼组、空白对照组。蝎毒多肽1、2、3组分别加入10、20、40μg/m L的蝎毒多肽20μL,伊马替尼组加入2 mg/m L的伊马替尼20μL,空白对照组加入生理盐水20μL,继续培养48 h。采用实时荧光定量PCR法检测各组Gli1 mRNA相对表达量,Western blotting法检测各组Gli1蛋白相对表达量。结果蝎毒多肽1、2、3组和伊马替尼组、空白对照组Gli1 mRNA相对表达量分别为1.983±0.091、1.355±0.093、1.279±0.105、1.302±0.074、2.745±0.188;Gli1蛋白相对表达量分别为0.902±0.057、0.722±0.074、0.693±0.097、0.701±0.067、0.981±0.063。蝎毒多肽1组Gli1 mRNA和蛋白相对表达量与空白对照组比较P均>0.05;蝎毒多肽2、3组及伊马替尼组Gli1 mRNA和蛋白相对表达量明显低于蝎毒多肽1组及空白对照组(P均<0.05);蝎毒多肽2、3组及伊马替尼组Gli1 mRNA和蛋白相对表达量比较P均>0.05。结论 20~40μg/m L的蝎毒多肽可明显抑制慢性粒细胞白血病细胞Gli1基因表达。