蝎毒活性肽BmK AS的基因克隆与表达

目的克隆东亚钳蝎活性肽BmKAS的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法利用PCR技术从蝎尾cDNA pool中扩增BmKAS基因,通过基因工程方法构建表达载体pET28a-BmKAS,在E.coli中进行表达,表达产物为包含体。采用分步稀释复性法对表达产物进行体外变复性。结果BmKAS以包含体的形式得到表达,表达量的质量约占菌体总蛋白质量的31%。表达产物复性后,通过离子交换柱层析进一步纯化,达到了电泳纯,收率为1.6 mg.L-1。结论首次对具有多种药理活性的蝎毒活性肽BmKAS进行了表达,并对表达产物进行体外变复性研究,获得了毫克级的收率,满足了深入研究需要。

蝎毒活性肽对兔血液流变性的影响

目的 为进一步揭示蝎毒活性肽的抗栓溶栓机制我们对蝎毒活性肽对兔血液流变性的影响进行了观察。方法 压力变换法测定全血粘度 (BV) ,血浆粘度 (PV) ,激光衍射法测定红细胞变形指数、聚集指数 (EDI ,EAI)。结果 ASP2 .5mg·kg 1,SVAPs 1.6 ,3.2mg·kg 1iv可明显降低PV <HCT <Fib ,EAI ,升高EAI,从而降低 2 0 0s 1和 3s 1BV。结论 SVAPs通过降低BV而改善兔血液流变性可能是其抗栓溶栓的作用机制之一。

蝎毒活性肽对同型半胱氨酸致血管内皮细胞损伤的差异蛋白表达谱的影响

目的研究蝎毒活性肽对同型半胱氨酸引起的血管内皮细胞损伤的蛋白表达谱的变化及其蛋白质组学机制。方法用二向电泳、图像分析、基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱鉴定等蛋白质组学技术测定同型半胱氨酸致血管内皮细胞损伤表达量有显著改变的蛋白质,Western blot测定血管内皮细胞锰超氧化物歧化酶、网钙蛋白1前体和钙网蛋白前体蛋白的表达。结果与空白对照组比,同型半胱氨酸组发现有11个蛋白点下调及1个蛋白点上调。与同型半胱氨酸组比,同型半胱氨酸+蝎毒活性肽组上调锰超氧化物歧化酶和网钙蛋白1前体,下调钙网蛋白前体的蛋白表达。结论靶蛋白的发现说明蝎毒活性肽可抵抗由高同型半胱氨酸引起氧化应激造成的血管内皮细胞损伤。

蝎毒活性多肽对内皮细胞释放PGI_2和NO的影响

目的 探讨蝎毒活性多肽 (SVAP)抗栓作用机制。方法 酶消化法培养人脐静脉内皮细胞 (HU VEC) ,放射免疫分析法测定HUVEC培养液中 6 Keto PGF1α的含量以反映PGI2 的变化 ,硝酸还原酶法测定NO的含量。结果 SVAP 1、5、10、2 0mg·L- 1均可明显增加HUVECPGI2 的释放 ,而SVAP 1、5mg·L- 1对NO的释放无明显影响 ,SVAP 10、2 0mg·L- 1可使NO释放量显著增加 ,PGI2 和NO释放量之间呈正相关。结论 SVAP抗栓机制可能与影响VEC合成或 (和 )分泌PGI2 ,NO以及NO与PGI2 二者之间协同及相互介导作用有关。

蝎毒活性多肽对兔和大鼠的血小板聚集、大鼠血浆中TXB_2,PGF_(1α)及血栓形成的影响

目的 :为进一步揭示蝎毒活性肽的抗栓机制。方法 :比浊法测定血小板聚集程度、电刺激法复制大鼠颈动脉血栓模型、放免法测定大鼠血浆中 6 keto PGF1α和TXB2 水平。结果 :蝎毒活性多肽 (SVAPs) 0 .12 5 ,0 .2 5 ,0 .5mg·mL-1对体外凝血酶 0 .0 3μ·mL-1,ADP 10 μ·mL-1诱导的血小板聚集有明显的抑制作用 (P <0 .0 5或 0 .0 1) ,且呈量效关系。舌静脉给药 ,大鼠颈动脉血流阻塞时间延长 (P <0 .0 5或 0 .0 1)。结论 :SVAPs抗栓作用可能与其抗血小板聚集 ,升高PGI2 /TXA2

蝎毒镇痛活性肽镇痛作用的研究

本文以行为及电生理反应方法研究了蝎毒镇痛活性肽（SAP）的镇痛作用。SAP是由东亚钳蝎毒经Sephadex柱层析反复分离纯化而成的多肽物物质。实验中利用大鼠光热甩尾法、小鼠热板法及扭体法证明SAP有很强的镇痛作用。SAP对大鼠三叉神经下颌分支刺激引起的皮层诱发电位N波有较强的抑制作用。对吗啡耐受的大鼠仍有较强的镇痛作用。

蝎毒活性多肽对大鼠肠系膜微循环的影响

目的 :研究蝎毒活性多肽对大鼠肠系膜微循环的影响。方法 :Dextran(分子量 480 0 0 0 ) 60 0mg/kg静脉注射制备大鼠肠系膜急性微循环障碍 (AMD)模型 ,采用活体微循环法观察肠系膜微循环细动、静脉血流速度 (ABFV ,VBFV)、血流状态 (BFS)、血管口径 (AD、VD)的变化。结果 :SVAPs 0 .0 7mg/kg、Nif 0 .0 5mg/kg静注可使ABFV增大各为 1 1 %、1 2 .3% ,VBFV则为 1 2 .5 %、1 2 .6% ,BFS改善 ,AD增加 2 0 %、36.8% ,VD增加 1 1 .7%、2 8% ,CN增多 ,静注SVAPs可明显逆转AMD。结论 :SVAPs可明显改善肠系膜微循环 ,并对Dextran诱导的AMD具有拮抗作用。

蝎毒纤溶活性肽预处理对缺氧血管内皮细胞抗凝和纤溶功能的影响

目的应用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧模型,探讨蝎毒纤溶活性肽(SVFAP)对缺氧损伤内皮细胞的保护作用。方法对培养的HUVECs传代并分组:对照组常规培养;缺氧组将其放入含95%N2、5%CO2混合气体的缺氧环境中培养12 h,制备HUVECs缺氧损伤模型;药物干预组分别将终浓度为2,4,8 mg/L的SVFAP加入细胞培养液中进行培养,1 h后进行缺氧模型复制。观察各组细胞培养上清液中漂浮细胞数、抗凝、纤溶指标等变化。结果与对照组相比,模型组培养液中的漂浮细胞数显著增高,前列环素(6-keto-PGF1α)和NO水平显著下降,组织型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)活性增高,组织型纤溶酶原激活物(t-PA)活性显著降低;蝎毒纤溶活性肽在较高剂量组能显著提高6-keto-PGF1α和NO水平、调节PAI-1和t-PA活性。结论实验制备的HUVECs缺氧损伤模型存在着内皮细胞(EC)受损,纤溶、抗凝功能失调;蝎毒纤溶活性肽对缺氧环境下受损EC具有保护作用。

蝎毒纤溶活性肽对血管内皮细胞分泌纤溶因子的影响

目的 研究蝎毒纤溶活性肽 (SVFAP)对血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活剂 (t -PA)和纤溶酶原激活剂抑制物 (PAI - 1)的影响。方法 将不同浓度SVFAP与脐静脉内皮细胞共同孵育 10min及 4h后 ,分别收集培养液 ,以发色底物法测定培养液中t-PA和PAI -1的活性。结果 SVFAP在用药后 10min及 4h各浓度大多使t-PA活性增强 ,PAI - 1活性降低 ,t-PA/PAI - 1比值升高。结论 SVFAP的纤溶作用与抑制内皮细胞分泌PAI - 1和促进t-PA释放有关。

蝎毒活性多肽对大鼠脑缺血-再灌注后c-fos表达的影响

目的:研究蝎毒活性多肽对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用,并观察该保护作用对Fos蛋白表达的影响。方法:采用左侧大脑中动脉插入栓线(MCAO)方法制作大鼠脑缺血-再灌注模型,观察蝎毒活性多肽对脑缺血大鼠神经功能的影响;用免疫组化方法标记各组大鼠脑组织顶叶皮质、尾壳核中c-fos阳性细胞数量。结果:蝎毒活性多肽可降低大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤行为学评分,改善因缺血所致神经行为功能缺失,且随着剂量的增加效应增强,并可以显著减少海马Fos阳性细胞的数量(P<0.05)。结论:蝎毒活性多肽对脑缺血损伤有一定的保护作用,且这种作用与其减少脑缺血早期c-fos表达有关。

蝎毒活性多肽对大鼠脑缺血-再灌注后IL-1B蛋白表达和神经功能的影响

目的:研究蝎毒活性多肽对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用,并观察该保护作用对白细胞介素-1B(interleukin- 1B,IL-1B)蛋白表达的影响。方法:采用左侧大脑中动脉插入栓线(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)方法制作大鼠脑缺血-再灌注模型,观察蝎毒活性多肽对脑缺血大鼠神经功能的影响;用免疫组化方法标记各组大鼠脑组织海马中IL-1B阳性细胞数量。结果:蝎毒活性多肽可降低大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤行为学评分,改善因缺血所致神经行为功能缺失,且随着剂量的增加效应增强,并可以显著减少海马IL-1B阳性细胞的数量(P<0．05)。结论:蝎毒活性多肽对脑缺血损伤有一定的保护作用,且这种作用与其减少脑缺血早期IL-1B表达有关。

蝎毒活性多肽对大鼠脑局灶性缺血再灌注后脑组织肿瘤坏死因子变化的影响

已有研究表明，脑缺血再灌注后，肿瘤坏死因子的释放可激活多形核白细胞，增加白细胞、内皮细胞粘附分子如细胞间粘附分子-1（in2tercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1）的表达，促进白细胞粘附于血管壁，并逐渐浸润至脑组织，通过释放多种炎症介质、氧自由基等，在缺血再灌注后的脑组织损伤中起重要作用。已有报道，拮抗TNF不仅可阻断TNF诱导细胞凋亡，还可减轻TNF激活炎性介质的致炎作用，缩小梗死体积。蝎毒是一种毒性仅次于蛇毒的生物毒素，主要由非蛋白和蛋白质组成，具有复杂的生理、药理活性，蝎毒通过分离纯化得到的蝎毒活性多肽（Scorpion venom active peptides，SVAPs）经研究说明具有纤溶作用．近年来研究发现蝎毒具有较强的抗脂质过氧化和氧自由基清除作用，并且对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。本研究旨在观察蝎毒活性多肽对局灶性缺血再灌注大鼠脑组织TNF含量的影响，并探讨与之有关的作用机制。

重组CD_(13)单链抗体和蝎毒素多肽AGAP融合蛋白真核表达及对NB4细胞的靶向杀伤作用

目的:本研究应用基因工程技术方法,构建含重组编码CD13单链抗体和蝎毒素镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide,AGAP)融合蛋白基因的表达载体,并研究CD13-AGAP融合蛋白对CD13阳性白血病细胞NB4影响。方法:克隆东亚钳蝎活性肽AGAP的基因,插入真核表达载体pSecTag2/CD13/RFP,得到pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体。酶切及测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染293T细胞,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测融合基因和蛋白的表达。纯化融合蛋白,作用NB4细胞,CCK8检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期。结果:酶切及测序结果证实pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体构建成功,转染293T细胞后,RT-PCR和免疫印迹方法结果证实重组质粒得到有效表达,并纯化真核表达融合蛋白CD13-AGAP对血液肿瘤CD13阳性白血病细胞NB4有一定的生长抑制作用,并且使细胞周期G1期阻滞,S期减少。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pSecTag2/CD13/AGAP,并在293T细胞中成功表达,进一步证实融合蛋白对CD13阳性白血病细胞NB4有杀伤作用。

蝎毒纤溶活性肽对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用研究

目的研究蝎毒纤溶活性肽对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法采用大鼠右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)2 h,再灌注24 h模型,造模前,蝎毒纤溶活性肽组分别静脉注射蝎毒纤溶活性肽0.1,0.2,0.4 mg·kg-1,尼莫地平组注射尼莫地平0.7 mg·kg-1,1次·d-1,连续7 d。分别以Longa′s法评定神经功能、红四氮唑(TTC)染色测定脑梗死体积及放射免疫技术检测血清炎性细胞因子TNF-α、IL-6以及IL-8等的变化。结果与模型组比较,蝎毒纤溶活性肽能明显改善大鼠MCAO后神经功能症状,缩小梗塞体积(P<0.05),并抑制血清炎性细胞因子TNF-α、IL-6及IL-8的表达(P<0.05)。结论蝎毒纤溶活性肽对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能与抑制炎性细胞因子表达有关。

蝎毒纤溶活性肽对低糖低氧/复氧损伤大鼠皮层神经元的保护作用

目的:研究蝎毒纤溶活性肽(SVFAPs)对大鼠神经元低糖低氧/复氧损伤的影响,探讨药物发挥神经保护作用的可能机制。方法:建立原代培养的大鼠皮层神经元的低糖低氧/复氧(OGD/R)模型,采用四唑蓝(MTT)法和乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞活力;检测细胞上清液中丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性;Hoechst染色和DNA片段法检测细胞凋亡;W estern b lot法检测PARP蛋白的表达。结果:经OGD/R损伤后细胞活力明显下降,细胞上清液中MDA、NO升高,SOD降低;出现凋亡典型的形态学特征,PARP蛋白表达下降;蝎毒纤溶活性肽(2～8mg/L)可不同程度提高低糖低氧/复氧后神经元的活力,降低细胞上清液MDA和NO含量,提高SOD活性。改善凋亡相关的细胞核形态学改变,并且减少凋亡特征性DNA片段化的发生,降低细胞凋亡率,保持PARP的完整性。结论:蝎毒纤溶活性肽对低糖低氧/复氧损伤的神经元具有保护作用,其机制可能与抗氧化和减轻细胞凋亡有关。

毕赤酵母Muts与Mut＋重组子表达蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1水平比较

蝎毒镇痛活性肽Bm K Ang M1是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离得到的一种新型长链蝎毒素,其镇痛活性强且毒性低,有望开发成镇痛新药。本文将Bm K Ang M1基因转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到甲醇利用缓慢型(Muts)和快速型(Mut+)的重组子;采用实时荧光定量PCR方法,检测了Mut+重组子中Bm K Ang M1基因的拷贝数,筛选出含单拷贝Bm K Ang M1基因的Mut+重组子;在相同培养条件下,比较了含单拷贝Bm K Ang M1基因的Muts和Mut+重组子表达Bm K Ang M1的水平。结果表明,Muts重组子中Bm K Ang M1基因转录水平是Mut+重组子的2.7倍,Muts重组子中Bm K Ang M1蛋白表达量是Mut+重组子的1.5倍。因此,Muts重组子比Mut+重组子具有更强的Bm K Ang M1表达能力。