蝎毒耐热蛋白对大鼠急性分离海马神经元兴奋性的影响(英文)

应用全细胞膜片钳记录技术在电流钳模式下观察经持续高温等特殊处理后分离纯化的30～50 kDa蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat resistant protein,SVHRP)(国家发明专利,专利号ZL01 1 06166．92)对急性分离大鼠海马神经元兴奋性的影响。结果发现SVHRP可致海马神经元兴奋性降低。神经元经1×10-1μg/mL SVHRP处理后动作电位发放模式改变,发放频率减少。在52个受检细胞中,有45个细胞产生位相放电(占86．54％);7个细胞产生重复放电(占13．46％)。在产生位相放电的45个细胞中,有8个细胞在SVHRP处理后仍可以诱发出位相放电(占17．78％);37个细胞在SVHRP处理后无法诱导出位相放电(占82．22％),SVHRP处理后动作电位的产生与处理前相比,有显著差异(P<0．01,n=45);在产生重复放电的7个细胞中,在1×10-2μg/mL SVHRP作用后均不能再次诱发出重复放电,而是产生一个动作电位或不再产生动作电位,药物处理前产生的动作电位个数为14．57±1．00,SVHRP处理后产生动作电位的个数为0．57±0．20,二者之间有显著性差异(P<0．01,n=7)。1×10-4μg／mL SVHRP处理后,诱发动作电位产生的基强度由(75．10±8．99)pA增加到(119．85±12．73)pA(P<0．01,n=8);阈电位由(-41.17±2.15)mV升至(-32．40±1．48)mV(P<0．01,n=8);动作电位峰值由(68．49±2．33)mV下降至(54．71±0．81)mV(P<0.01,n=8)。由于神经元超兴奋性被认为是癫痫发作的基本机制之一,因此上述结果表明SVHRP有可能通过降低海马神经元兴奋性发挥其抗癫痫作用,这为蝎毒药物的进一步开发提供理论依据。

蝎毒耐热蛋白对大鼠海马神经元钠通道的抑制作用

应用全细胞膜片钳技术观察蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat resistant protein,SVHRP)对急性分离大鼠海马神经元电压依赖性钠通道的影响。结果表明,急性分离大鼠海马神经元产生的河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的电压依赖性钠电流被SVHRP浓度依赖性地抑制,半数抑制浓度为(0.0034±0.0004)μg/mL,Hill常数为0.4361±0.0318;SVHRP可使钠通道稳态激活曲线向电压的正方向移动,正常TTX敏感的钠通道的半数激活电压(V1/2)为(-34.38±0.62)mV(n=16),给予0.1μg/mL的SVHRP后V1/2为(-23.96±0.41)mV(n=8,P<0.05),斜坡因子(κ)由正常的4.52±0.52变为3.73±0.08(n=8,P<0.05)。SVHRP亦能改变电压依赖性钠通道的稳态失活曲线,使其向电位的负方向移动,SVHRP处理前钠通道半数失活电压(V1/2)为(-32.60±1.52)mV,κ为6.73±0.51(n=16);0.1μg/mL的SVHRP处理后V1/2变为(-50.69±2.55)mV(n=8,P<0.01),κ为5.49±0.72(n=8,P<0.05)。结果提示,SVHRP能抑制电压依赖性钠电流,改变钠通道的动力学特性,抑制其激活,促进其失活,从而影响神经元的兴奋性,这可能是其抗癫痫的机制之一。

泮库溴铵对大鼠颈上交感神经元全细胞N型钙通道电流的影响及其机制的探讨

目的 研究泮库溴铵对大鼠颈上交感神经元细胞N型钙通道电流的影响。方法 酶 -机械法急性分离大鼠颈上交感神经元 (SCG)细胞。采用全细胞膜片钳技术 ,记录N型钙通道电流。通过自制“Y”型加药系统将以标准细胞外液稀释的泮库溴铵灌流至细胞周围。记录灌流前、灌流 30s后和冲洗 30s后的N型钙电流。在细胞内液内加入非水解性G蛋白抑制剂GDP·βS ,然后再以 10 μmol/L泮库溴铵灌流后观察N型钙电流的变化。结果 1、4、10、4 0 μmol/L的泮库溴铵可以使钙电流分别增强 12 .6 %、2 4 .2 %、5 6 .6 %和 2 1.9% ,而 10 0和4 0 0 μmol/L的泮库溴铵则分别使N型钙电流减少 14 .1%和 2 5 .5 %。在电极内液中加入G蛋白的非水解性竞争性拮抗剂GDP·βS后 ,10 μmol/L的泮库溴铵对N型钙电流的增强作用消失。 结论 较低浓度的泮库溴铵通过抑制G蛋白调控机制增强交感神经元N型钙通道电流 。

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征

【目的】体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞并探讨其内向整流钾电流(IK1)特征。【方法】采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法鉴定诱导细胞,并采用全细胞膜片钳技术检测IK1表达。【结果】诱导后细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。14d后细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin、α-sarcomericactin和心肌特异性cTnI呈阳性反应,RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达。诱导细胞IK1表达呈明显的不均一性,部分细胞IK1与正常心室肌细胞相似,但IK1电流密度总体上低于正常心室肌细胞。【结论】5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化;诱导细胞IK1表达不均一性提示可能有致心律失常潜能。

P物质通过蛋白激酶C抑制牛蛙初级感觉神经元的GABA激活电流(英文)

目的 探索P物质对牛蛙背根神经节神经元γ -氨基丁酸激活电流抑制的机制或途径。方法 实验采用的方法是全细胞膜片钳技术 ,实验材料为急性分离的牛蛙背根神经节神经元。结果 P物质在牛蛙背根神经节神经元能引起一缓慢的内向电流 ;并且P物质能明显抑制牛蛙背根神经节神经元γ -氨基丁酸激活电流 ;蛋白激酶C的抑制剂H - 7(5 0ЧM)能阻断此抑制作用。结论 P物质可能通过蛋白激酶C抑制γ

百日咳毒素对抗性及敏感棉铃虫神经细胞L型钙通道的调制作用

通过催化抑制性G蛋白α亚基(Gαi／o)的ADP核糖基化,百日咳毒素(PTX)使Gαi／o不能活化,继而抑制Gαi／o-腺苷酸环化酶(AC)-cAMP-蛋白激酶A(PKA)-L型电压门控钙(Ca(L)2+)通道．Ca(L)2+通道可能是拟除虫菊酯类杀虫剂的靶标．本实验观察了PTX对三氟氯氰菊酯(Cy)抗性及敏感棉铃虫神经细胞Ca(L)2+通道的影响, 以期从Ca(L)2+通道动力学的角度探讨棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的机制．急性分离并经12-16 h无菌培养3-4龄棉铃虫神经细胞．实验分4组:①Cy敏感组(Cy-S组);②Cy抗性组(Cy-R组);③Cy-S-PTX组; ④Cy-R-PTX组．400 ng／mL PTX加入培养基中．采用全细胞膜片钳技术记录各组,ICa(L)．结果显示:(1)各组 Ca(L)2+通道的激活电压均是-35--30 mV,最大激活电压是0 mV,但Cy-S-PTX组的最大激活电压是 -10 mV;(2)分别与Cy-S组和Cy-R-PTX组峰值电流密度相比,Cy-S-PTX组峰值电流密度分别增高52．06 ％和44．81％(P<0．01),提示Cy-S-PTX组Ca(L)2+通道电导可能增大．Cy-S组和Cy-R组间的峰值电流密度无统计学差异;(3)与Cy-S组相比,Cy-S-PTX组神经细胞Ca(L)2+通道的半数激活电压向超极化方向移动5．1 mV (P<0．05),半数失活电压向超极化方向移动5．93 mV(P<0．05),提示PTX使敏感组神经细胞的Ca(L)2+通道更容易激活和失活;(4)与Cy-R组相比,Cy-R-PTX神经细胞Ca(L)2+通道的半数激活电压几乎未变,半数失活电压向去极化方向移动2．42 mV(P>0．05),提示PTX对抗性组神经细胞的影响不明显;(5)Cy-R组与Cy-S组神经细胞Ca(L)2+通道的半数激活电压和半数失活电压无显著性差异．结果提示:(1)棉铃虫神经细胞存在(Gαi／o)-AC- cAMP-PKA-Ca(L)2+通道信号传导途径;(2)PTX敏感的抑制性Gi／o蛋白的基础活性对棉铃虫神经细胞Ca(L)2+通道有影响;(3)PTX对敏感虫神经细胞的Ca(L)2+通道的影响较对抗性棉铃虫神经细胞Ca(L)2+通道的影响明显,提示抗性棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的机理可能与其Ca(L)2+通道对Gαi／o-AC-cAMP-PKA-Ca(L)2+通道调控不敏感有关．

P物质通过PKC ε抑制GABA激活电流

目的:揭示P物质(substance P,SP)在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元对GABA激活电流的调节机制。方法:运用全细胞膜片钳记录技术,在新鲜分离的DRG神经元记录GABA激活电流,以及SP对该电流的调节。结果:使用GABA(1～1000μmol/L)能引起大多数DRG神经元(89.8%,114/127)产生浓度依赖性的内向电流,这一内向电流是由GABAA受体介导的,GABA(100μmol/L)激活内向电流的幅值为1.9±0.6 nA(n=21)。预加SP(0.001～1μmol/L)能明显抑制GABA激活的内向电流,SP对GABA激活内向电流的抑制作用能被选择性的NK1受体的阻断剂spantide(20μmol/L,n=7)阻断,但不能被选择性NK2和NK3受体的阻断剂L659187(1μmol/L,n=7)和SR142801(1μmol/L,n=7)阻断。SP对GABA激活内向电流的抑制作用也能被胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)的抑制剂U73122、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的抑制剂chelerythrine所阻断。另外,SP对GABA激活内向电流的抑制作用能被PKCε的阻断剂epilon V1-2特异性地阻断。结论:预加SP激活NK1受体,通过激活G-蛋白-PLCCa2+-PKCε途径磷酸化GABAA受体,抑制GABA激活内向电流,表明SP可通过抑制GABA介导的突触前抑制(pre-synaptic inhibition)易化伤害性信息在初级感觉的传递(尤其是痛觉)。

何首乌二苯乙烯苷对大鼠海马神经元L型钙离子通道的影响

目的研究二苯乙烯苷对大鼠海马神经元L型钙离子通道的影响。方法用全细胞膜片钳技术记录大鼠海马神经元钙通道电流。结果①细胞外给予2.0和6.0μmol/L二苯乙烯苷对正常的高电压激活钙通道电流的抑制差异不具有统计学意义(P>0.05)。②细胞外给予1μmol/L的Aβ后再分别给予2.0和6.0μmol/L二苯乙烯苷,显示L型钙电流/电压(I-V)曲线逐渐上移,但对钙离子的抑制作用与Aβ组差异无统计学意义(P>0.05)。结论二苯乙烯苷对大鼠海马神经元L型钙离子通道可能不具有影响。

神经调节蛋白-1对小鼠心室肌细胞L型钙电流的影响

目的观察神经调节蛋白-1(NRG-1)对大鼠心室肌细胞L型钙电流(ICa-L)的影响。方法 C57小鼠取其心脏,经主动脉逆行插管后行Langendorff灌流,以酶解法分离获得单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术,记录NRG-1对L型钙电流(ICa-L)的影响。结果 0.05,0.1,0.2μmol/L NRG-1对ICa-L峰电流的抑制率分别为15.3%±2.2%,32.0%±4.7%,52.6%±6.1%(n=6,P<0.05),并使电流-电压曲线上移,激活延迟,失活后恢复时间延长。结论 NRG-1通过延迟钙通道的激活,延长失活后恢复时间,抑制心肌细胞ICa-L。

蛋白激酶C对人心房肌细胞肿胀激活的氯离子电流的调节作用

人心房肌细胞肿胀激活的氯离子电流（Icl.swell）被作为心律失常一个潜在的治疗靶点,但对于其调节机制目前仍不是很清楚.我们通过全细胞膜片钳技术观察蛋白激酶C（PKC）对人心房肌细胞Icl.swell的调节作用.

骨髓间充质干细胞来源的微颗粒对心肌肥厚的作用及其机制

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的微颗粒(microparticles,MPs)对心肌肥厚的作用及其机制。方法 对间充质干细胞(MSCs)进行成骨成脂诱导分化,经分离纯化后,透射电镜观察形态特征,流式细胞术鉴定MPs表面抗原。利用异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)诱发建立大鼠心肌肥厚模型,超声心动图检测大鼠心脏结构及功能后,进行心脏及分离的左心室的各项指标检测。将急性分离的大鼠单个心肌细胞分为对照(Control)、心肌细胞肥大(ISO)、MPs、MPs上清液(Supernatant)组,qRT-PCR法检测心肌细胞心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑利钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)mRNA表达量;ELISA法检测心肌细胞钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylated calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,p-CaMKⅡ)表达量;全细胞膜片钳记录各组大鼠单个心肌细胞L-型钙电流(LCa-L)。结果 MSCs成骨分化骨结节经茜素红染色后变成红色,成脂分化脂滴经油红O染色后变成红色;透射电镜下可见MPs膜结构完整,轮廓清晰,直径约200 nm;MPs表面标记物CD29和CD90表达阳性率分别为(98.24±0.82)%和(97.69±1.83)%。与Control组相比,ISO组大鼠左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension,LVEDD)明显减少(t=5.065,P <0.05),室间隔舒张末期厚度(interventricular septum end-diastolic dimension,IVSd)、左心室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall dimension,LVPWd)、心重-体重比(heart weight to body weight ratio,HW/BW)、心重-胫骨长度比(heart weight to tibial length ratio,HW/Tibia)、左心重-胫骨长度比(left heart weight to tibial length ratio,LV/Tibia)明显升高(t分别为4.013、2.368、4.392、5.043、6.120,P均<0.05),建模成功;ISO组大鼠肥大心肌细胞ANP、BNP mRNA表达量均较Control组明显升高(t分别为25.120、18.261,P均<0.01);经48μg/mL MPs孵育48 h后的MPs组ANP、BNP mRNA表达量较ISO组显著下降(t分别为12.110、3.526,P均<0.05);ISO组CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达水平较Control组显著升高(t分别为3.278、4.181,P均<0.05),MPs组p-CaMKⅡ蛋白表达水平显著下降(t=5.420,P <0.05);ISO组钙电流密度较Control组明显增高(t=15.261,P <0.01),MPs组较ISO组明显降低(t=6.216,P <0.05)。结论 MSC-MPs可显著抑制ISO诱导的大鼠心肌细胞肥大,这一效应与其下调心肌细胞CaMKⅡ、抑制L-型钙通道有关。

慢性脓毒症对大鼠离体肌纤维电压门控钠离子通道的作用

最近法国科研人员在神经细胞未受损的大鼠模型中研究了慢性脓毒症对特定钠离子通道亚型的电生理学作用。实验对Wistar大鼠行盲肠结扎穿孔制成慢性脓毒症模型。术后10d处死大鼠。截取趾短屈肌快纤维，在含有胶原蛋白酶（3．0g／L）的酸性缓冲盐中进行分离。室温下（22±2）℃用全细胞膜片钳技术记录快速的钠电流。结果显示，钠Nernst电位无改变，最大钠电流和电导下降，以及电压失活曲线朝向负电位转变解释了观察到的肌纤维兴奋性下降现象。研究人员还观察到NaV1.5型钠通道蛋白的上调。研究者认为，慢性炎症和脓毒症可以诱发钠通道性质或类型的改变，引起肌纤维兴奋性下降，这种兴奋性的下降可能由NaV1．5型钠通道蛋白的上调引起。

过表达SOD_1 G41S和G41D的重组腺相关病毒载体构建及其在体外N2a细胞中的作用研究

目的研究家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)超氧化物歧化酶1(SOD_1)上G41S和G41D两种突变型所致神经元电压门控性钠通道(Na_v)电生理特性的差异及其可能的分子机制。方法构建过表达SOD_1野生型(WT)、SOD_1G41S及SOD_1G41D重组腺相关病毒(rAAV)载体后,体外感染小鼠神经瘤母细胞(N2a),并分为3个实验组:SOD_1WT组、SOD_1G41S和SOD_1G41D组,并以无目的基因rAAV感染的N2a细胞为阴性对照组。利用全细胞膜片钳技术分别记录4组细胞Na_v电流,绘制通道快速激活和稳态失活曲线后分析相关参数。比较各组细胞凋亡分子cleaved caspase-3在感染后24、48和72 h不同时间点的表达情况。结果与对照组和SOD_1WT组比较,感染过表达SOD_1G41S组、SOD_1G41D组rAAV的细胞峰值电流显著增加(P<0.05),且SOD_1G41S组显著高于SOD_1G41D组(P<0.01)。SOD_1G41S组和SOD_1G41D组细胞半数激活电压和半数失活电压显著高于对照组和SOD_1WT组(P<0.05);但SOD_1G41S组半数激活电压高于SOD_1G41D组(P<0.05);SOD_1G41S与SOD_1G41D组半数失活电压比较差异无显著性(P>0.05);各组激活、失活曲线斜率差异无显著性(P>0.05)。虽然24和48h,SOD_1WT、SOD_1G41 S、SOD_1G41D组cleaved caspase-3表达量差异无显著性;但转染72 h后,SOD_1G41S组和SOD_1G41D组cleaved caspase-3表达量高于SOD1WT组,且SOD_1G41S组高于SOD_1G41D组。结论SOD_1G41S和SOD_1G41D突变通过加快Na_v快速激活和抑制失活过程提高神经元活性,SOD_1G41S突变Na_v活性显著高于SOD_1G41D。SOD_1G41S突变导致cleaved caspase-3表达水平高于SOD_1G41D突变。

自发性高血压大鼠和Wistar大鼠脑动脉Cx45表达的差异

目的探讨脑动脉细胞间缝隙连接在高血压病中的变化。方法应用全细胞膜片钳、定量RT-PCR和Western blot技术,比较自发性高血压(SH)大鼠(n=30)和Wistar大鼠(n=30)脑动脉上缝隙连接耦联力,以及连接蛋白45(Cx45)在mRNA和蛋白水平的表达。结果①应用全细胞膜片钳技术发现,SH大鼠脑动脉平滑肌细胞膜电容和膜电导都明显高于正常Wistar大鼠(P<0.05),提示SH大鼠脑动脉平滑肌细胞间的缝隙连接耦联力增强。②应用定量RT-PCR技术发现,SH大鼠脑动脉Cx45 mRNA的表达升高(P<0.05)。③应用Western blot发现,SH大鼠脑动脉Cx45的蛋白表达升高(P<0.01)。结论 SH大鼠可能通过上调平滑肌细胞上Cx45的表达,增强脑动脉平滑肌细胞间缝隙连接通讯,保证血管的同步收缩。

氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马电压门控性Ⅰ型钠通道的变化

目的研究氯化锂-匹罗卡品癫痫模型大鼠海马Ⅰ型电压门控性钠通道α亚基蛋白(Nav1.1)及其钠通道功能的变化。方法建立氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型。采用免疫组织化学染色法(IHC)检测实验大鼠海马Nav1.1的表达;采用全细胞膜片钳技术检测钠通道功能(电流-电压曲线、激活曲线、失活曲线及失活后恢复曲线)的变化。结果1.成功复制氯化锂-匹罗卡品大鼠模型。观察到实验大鼠行为学3期(急性期、潜伏期和慢性期)的表现,而空白组未见发作。2.IHC结果:致痫大鼠海马CA1区和DG区神经元结构基本正常,且Nav1.1的表达变化不明显。在CA3区,神经元变性、坏死明显,Nav1.1在神经元变性、坏死部位染色变浅,甚至消失;在变性、坏死神经元周围的正常组织中染色增强,与空白组比较,模型组大鼠Nav1.1的表达增高(0.235±0.008比0.210±0.002),差异有统计学意义(t′=-7.426,P<0.05)。3.全细胞膜片钳技术记录钠电流结果:与空白组比较,模型组的钠电流密度明显增加[(-319.70±28.24)pA/pF比(-229.06±26.01)pA/pF,t=8.178,P<0.05]、激活曲线阈值下降(4.15±0.80比4.50±0.85,t=11.020,P<0.05)、失活曲线阈值上升(7.47±0.53比6.24±0.31,t=6.940,P<0.05)、失活后恢复时间缩短[(1.36±0.15)ms比(1.86±0.21)ms,t=6.712,P<0.05],差异均有统计学意义。结论反复癫痫发作可以导致Nav1.1代偿性表达增多,钠通道电流密度明显增高,而激活曲线阈值下降、失活曲线阈值上升、失活后恢复时间缩短,最终引起大鼠神经元兴奋性增高,更易引起癫痫发作。