蝎毒肽作为Kv1.3离子通道阻滞剂研究进展

由于毒性低、疗效好、易获得等优点,天然产物已成为治疗一些疾病的重要药物来源。来源自蝎子的蝎毒肽已用于治疗自身免疫等多种疾病,其主要机制是通过抑制离子通道而产生治疗作用,Kv1.3通道是其主要作用靶点。本文总结了蝎毒肽作为阻滞剂作用于Kv1.3离子通道治疗自身免疫性疾病、肿瘤、炎症、凝血等方面的研究进展,并阐述了其作用机制,以期为蝎毒肽的进一步的开发利用提供依据。

蝎毒肽对兔血小板聚集的抑制作用

应用体外血小板聚集实验，观察了３种蝎毒肽（Ｓｃｉｒｐｉｏｎｖｅｎｏｍｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＳＶＰ）对凝血酶诱导的家兔血小板聚集抑制作用，以期从蝎毒中筛选具有纤溶和溶栓活性的有效成分。应用０．１２５，０．２５，０．５０ｍｇ·ｍｌ－１各３个剂量组的ＳＶＰ，ＳＶＰ２，ＳＶＰ３对凝血酶０．０３Ｕ·ｍｌ－１（终浓度）诱导的血小板聚集有显著的抑制作用。其抑制率分别为１．５１％，１．７２％，１０．８７％；１２．０１％，２５．２２％，２８．１２％；０．９４％，６．５２％，１５．５２％。结果提示：蝎毒肽的不同提取物可不同程度地抑制兔血小板聚集，其中以ＳＶＰ２作用最强，且有量效相关性。

基于PI3K/Akt信号通路探索黄芪甲苷Ⅳ-蝎毒多肽对前列腺癌细胞增殖、迁移及自噬的作用机制

目的:探索黄芪甲苷IV和蝎毒多肽对前列腺癌细胞活性、迁移、凋亡、周期、自噬及对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。方法:将人前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3随机分为空白对照组、黄芪甲苷IV组、蝎毒多肽组,黄芪甲苷IV-蝎毒多肽组,雷帕霉素(阳性药物组)组,各组给予对应的药物处理24 h后,取对数生长期的肿瘤细胞进行检测。采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)、Transwell试剂盒、凋亡试剂盒、细胞周期检测试剂盒、免疫荧光分析检测各组前列腺癌细胞活性、迁移能力及对细胞凋亡、周期、自噬靶点LC3的影响。Western印迹法用于检测p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Beclin1、LC3、P62的蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,黄芪甲苷IV-蝎毒多肽组前列腺癌细胞活性降低(P<0.05)、细胞穿模数(迁移能力)减少(P<0.05);前列腺癌细胞早期凋亡率(LR)、晚期凋亡率(UR)及总凋亡率均增高(P<0.05);G1期细胞占比增高(P<0.05)、G2+S期占比降低(P<0.05);LC3免疫荧光表达量显著增加(P<0.05);上调了前列腺癌细胞LNCaP、PC-3中LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表达(P<0.05);下调了P62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白的表达(P<0.05)。且黄芪甲苷IV-蝎毒多肽在抑制前列腺癌细胞活性及迁移能力、抑制细胞有丝分裂、促进细胞早期凋亡及上调LC3表达水平、抑制PI3K/AKT通路和促进自噬靶点优于单独黄芪甲苷IV组或蝎毒多肽组(P<0.05)。结论:黄芪甲苷IV-蝎毒多肽抑制前列腺癌细胞增殖迁移、抑制细胞有丝分裂、促进细胞早期凋亡及促进自噬的机制可能与抑制PI3K/AKT通路有关。

蝎毒多肽优化体CT-K3K7抗食管癌的机制研究

目的探讨蝎毒多肽优化体CT-K3K7对食管癌细胞的作用及机制。方法采用CCK-8法检测蝎毒多肽优化体CT-K3K7对食管癌细胞KYSE70与KYSE150增殖的影响;克隆形成实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150克隆形成的影响;划痕实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞迁移能力的影响;PI吸收实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150的细胞膜完整性的影响;流式细胞术检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞线粒体膜电位、ROS水平及凋亡率的影响;Western blot检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞中3种凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达水平的影响。结果蝎毒多肽优化体CT-K3K7作用后,食管癌细胞KYSE70与KYSE150的增殖与迁移能力受到抑制;细胞膜通透性增强;细胞内线粒体膜电位降低、ROS富集且细胞凋亡率明显升高;抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达量随着CT-K3K7作用浓度的升高显著下调,而促凋亡蛋白Bax和凋亡效应蛋白Caspase-3表达量则随着CTK3K7的作用浓度升高显著上调。结论CT-K3K7能显著抑制食管癌细胞的增殖和迁移,其机制可能是通过破坏细胞膜直接杀伤食管癌细胞,还可能通过影响食管癌细胞线粒体功能从而诱导细胞凋亡。

抗痛蝎多肽的分离与筛选

东亚钳蝎(Buthusmartensii Karsch)是我国重要的中药材之一,其毒液富含多种离子通道及受体的调制分子,对疼痛,癫痫等疾病有治疗作用。因此,针对蝎毒素中复杂多肽的分离、筛选与鉴定是蝎毒素研究与开发的重点。为了分离并筛选出具有镇痛效果的蝎毒多肽,实验利用反相高效液相色谱的方法分离纯化蝎毒,将得到的4种蝎毒多肽组分分别命名为BmKⅡ-10、BmKⅡ-11、BmKⅡ-16和BmKⅡ-24,结合质谱技术鉴定其分子量分别为7530.8 Da、7366.0 Da、5949.6 Da和6852.4 Da。通过构建疼痛模型检测蝎毒多肽组分对小鼠疼痛的影响,结果显示,BmKⅡ-10,BmKⅡ-11可能为蝎毒中的致痛组分,而BmKⅡ-16具有显著的镇痛效果,能有效抑制由福尔马林和角叉菜胶引起的自发痛与机械痛行为。本研究所采用的多肽分离纯化方法能有效获得蝎毒素中多种多肽组分,进一步验证发现部分组分与疼痛密切相关,为疼痛药物的开发与应用提供了理论和实验依据。

蝎毒多肽的镇痛及抗炎作用

采用热板法和醋酸扭体法证明腹腔注射蝎毒多肽０．６５０，０．４３３ｍｇ／ｋｇ能明显升高小鼠痛阈和减少小鼠的扭体次数．腹腔注射蝎毒多肽０．４３３，０．２１６ｍｇ／ｋｇ能明显对抗蛋清所致的大鼠足肿胀；连续７天腹腔注射蝎毒多肽０．２６０，０．１３０ｍｇ／ｋｇ能明显抑制大鼠棉球肉芽肿形成；腹腔注射蝎毒多肽０．６５０，０．

东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响及其诱导凋亡的初步机制。方法:将人肝癌细胞株Hep G2浸润在不同浓度的蝎毒多肽组分Ⅲ溶液中,应用DNA凋亡梯状带分析法和DNA末端转移酶介导的末端标记法(TUNEL法)测定凋亡的发生及凋亡率;用Western blotting方法观察Bcl-2蛋白和Caspase-3的表达量。结果:蝎毒多肽组分Ⅲ引起的肝癌细胞株Hep G2凋亡呈剂量依赖性变化。DNA凋亡呈现明显的梯状带电泳行为。经5、10、50、100及200 mg.L-1蝎毒多肽组分Ⅲ处理12 h后,肝癌细胞凋亡率分别为(6.1±3.0)%、(15.3±4.9)%、(48.5±5.2)%、(66.7±6.5)%和(91.2±6.9)%。凋亡伴随着bcl-2基因的表达下调,在凋亡过程中Caspase-3被激活。结论:东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ可以促进人肝癌细胞株Hep G2的凋亡,并且这种凋亡可能与通过下调bcl-2基因和激活Caspase-3途径有关。

蝎毒多肽提取物抑制DU-145细胞COX-2和MMP-9表达的研究

目的:研究蝎毒多肽提取物(peptide extract from scorpion venom,PESV)对雄激素非依赖性人前列腺癌细胞株DU-145COX-2和MMP-9表达的影响,进一步探讨其抗血管生成的分子机制,为抗前列腺癌骨转移提供有效的治疗手段。方法:采用免疫组只化学方法检测PESV对COX-2、MMP-9蛋白表达的影响,应用RT-PCR检测PESV对MMP-9在mRNA水平表达的影响。结果:蝎毒多肽提取物(40μg/mL)作用于前列腺癌细胞后,COX-2、MMP-9蛋白表达水平明显下调(P<0.05),进一步检测发现MMP-9在mRNA水平亦明显下降(P<0.05)。结论:蝎毒多肽提取物(PESV)通过抑制前列腺癌细胞血管生成因子COX-2的表达而发挥其抗血管生成作用,具有临床应用价值。

蝎毒多肽干预白血病细胞浸润效应及分子机制

白血病经化疗、放疗及骨髓移植等手段仍然不能治愈的主要原因之一是白血病细胞浸润，急性白血病，尤其是伴有粒单分化的髓系细胞或T淋巴细胞常常并发髓外组织浸润。随着科技进步，急性白血病治疗缓解率得到提高，但缓解后，髓外浸润组织的白血病细胞可能再次播散造成复发。本课题即是对中药全蝎提取物蝎毒多肽（PESV）干预白血病细胞浸润效应及分子机制进行了深入研究。

蝎毒多肽提取物对白血病小鼠Bcl-2 SDF-1α与TGF-β1表达的影响

目的:探讨蝎毒多肽提取物(PESV)对白血病小鼠Bcl-2、SDF-1α与TGF-β1表达的影响,探究PESV对白血病细胞增殖和浸润的影响与机制。方法:NOD-SCID小鼠60只,按本课题前期研究方法,建立人白血病NOD-SCID小鼠髓外浸润模型。选取造模成功的小鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别为高、中、低剂量组和模型组,另设同周龄正常NOD-SCID小鼠10只为空白对照组。高、中、低剂量组每只分别尾静脉注射PESV 1.2mg/(kg·d)、0.6mg/(kg·d)、0.3mg/(kg·d),模型组和空白组每只均尾静脉注射0.9%的生理盐水0.3mL/d,35d后全部处死,取血清和骨髓细胞培养液上清,用ELISA法进行Bcl-2、SDF-1α与TGF-β1的检测。结果:高、中、低剂量组存活率均高于模型组,高、中、低剂量组小鼠血清以及骨髓的Bcl-2、SDF-1α均明显低于模型组(P<0.05),而TGF-β1均高于模型组,均以高剂量组效果最为明显(P<0.05)。结论:蝎毒多肽提取物可以有效的降低白血病小鼠血清及骨髓中Bcl-2、SDF-1α的表达,提高TGF-β1的表达,具有较好的阻抑白血病细胞增殖和浸润的作用。

蝎毒多肽提取物对白血病小鼠E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响

目的探讨蝎毒多肽提取物(PESV)对E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响,探究PESV对白血病细胞髓外浸润的影响与机制。方法NOD-SCID小鼠50只,建立人白血病NOD-SCID小鼠髓外浸润模型,随机分为5组,每组10只,分别为PESV高、中、低剂量组,模型组和空白组。PESV高、中、低剂量组小鼠分别尾静脉注射PESV1.2,0.6,0.3 mg/kg,模型组和空白组均注射0.9%的生理盐水0.3 ml,治疗28 d后,用流式细胞术检测小鼠外周血中CD49d和CXCR4的表达,35 d处死小鼠后用免疫组化法检测其肝脏中E-钙黏蛋白表达。结果治疗组CD49d和CXCR4的表达均低于模型组(P<0.01),各治疗组E-钙黏蛋白表达均高于模型组(P<0.01)。结论PESV可以有效地提高白血病小鼠E-钙黏蛋白的表达,降低CD49d和CXCR4的表达,具有较好的阻抑白血病细胞髓外浸润的作用。

蝎毒多肽提取物对白血病细胞粘附力影响的实验研究

目的观察蝎毒多肽提取物(PESV,防治白血病中药提取物)对抑制人白血病原代细胞粘附力的影响。方法以人白血病原代细胞为研究对象,台盼蓝拒染法检测PESV对人白血病原代细胞的细胞毒作用;观察其对白血病原代细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附的影响。结果PESV在对细胞最佳作用浓度15μg.mL-1下,能够明显抑制人白血病原代细胞与HU-VEC的粘附,抑制率为(52.18±21.01)%;各浓度组与阳性对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。结论PESV在对细胞最佳作用浓度下,对人白血病原代细胞的黏附力有明显抑制作用。

蝎毒活性多肽对内皮细胞释放PGI_2和NO的影响

目的 探讨蝎毒活性多肽 (SVAP)抗栓作用机制。方法 酶消化法培养人脐静脉内皮细胞 (HU VEC) ,放射免疫分析法测定HUVEC培养液中 6 Keto PGF1α的含量以反映PGI2 的变化 ,硝酸还原酶法测定NO的含量。结果 SVAP 1、5、10、2 0mg·L- 1均可明显增加HUVECPGI2 的释放 ,而SVAP 1、5mg·L- 1对NO的释放无明显影响 ,SVAP 10、2 0mg·L- 1可使NO释放量显著增加 ,PGI2 和NO释放量之间呈正相关。结论 SVAP抗栓机制可能与影响VEC合成或 (和 )分泌PGI2 ,NO以及NO与PGI2 二者之间协同及相互介导作用有关。

蝎毒多肽提取物对肺癌荷瘤裸鼠血流变学的影响

目的观察蝎毒多肽提取物(PESV)对肺癌荷瘤裸鼠血流变学的影响。方法移植肺癌荷瘤裸鼠随机分为PESV组(皮下注射PESV)与对照组(皮下注射生理盐水)。采用FA SCO-300型全自动表观黏度快测仪对两组的全血黏度进行检测。结果与对照组相比,PESV组血流变学指标均有不同程度的降低,尤其是全血低切表观黏度、全血高切表观黏度、C asson黏度、C asson屈服应力均明显低于对照组(P<0.01)。结论PESV可降低荷瘤裸鼠血液黏度,对肺癌荷瘤裸鼠肿瘤转移能力有明显的抑制作用。

蝎毒多肽提取物对白血病细胞株K562/A02荷瘤鼠耐药性的影响

目的探讨蝎毒多肽(peptide extract from scorpion venom,PESV)逆转白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)在体内多药耐药(multidrug resistance,MDR)的分子机制。方法以多药耐药的K562/A02细胞株成模白血病BALB/c裸鼠为例,成模鼠随机分为6组:模型对照组、阿霉素(ADM)组、PESV组、ADM+PESV(H)组、ADM+PESV(M)组、ADM+PESV(L)组。模型对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液腹腔注射,其余各组予相应剂量ADM和(或)PESV腹腔注射,连续给药14天。第21天观察各组裸鼠移植瘤生长情况,分别检测瘤块中LSC:细胞膜上P-gp的表达,细胞质中ALDH、PI3K的变化及细胞核中MDR1、NF-κB的活性。结果 K562/A02细胞经免疫磁珠分选前后的CD34+CD38-细胞比率和IC50值分别为31.5%、(60.33±10.68)μg/ml和92.8%、(58.33±9.72)μg/ml,分选后细胞干性显著提高,而耐药性无差异性损失;各组造模裸鼠成瘤率100%。瘤体中LSC:流式细胞仪检测细胞膜上P-gp表达结果:检测对照组89.8%、ADM组91.9%、PESV组88.4%、ADM+PESV(H)组53.9%、ADM+PESV(M)组78.0%、ADM+PESV(L)组78.7%;半定量RT-PCR检测MDR1 m RNA的表达:PESV组>ADM+PESV(L)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(H)组>ADM组;免疫组织化学检测ALDH,显示灰度值ADM组>PESV组>ADM+PESV(H)组>ADM+PESV(M)组>ADM+PESV(L)组;Western blot检测PI3K分子与Elisa检测NF-κB因子结果一致,在ADM组、PESV组表达上调,在ADM+PESV组中表达下调,下调强度与PESV剂量呈正相关。结论 PESV具有下调白血病干细胞膜上P-gp,细胞质内ALDH、PI3K及细胞核中MDR1、NF-κB的表达水平,增强了白血病K562/A02干细胞在体内对ADM的敏感度,逆转其多药耐药特性。

蝎毒活性多肽对兔和大鼠的血小板聚集、大鼠血浆中TXB_2,PGF_(1α)及血栓形成的影响

目的 :为进一步揭示蝎毒活性肽的抗栓机制。方法 :比浊法测定血小板聚集程度、电刺激法复制大鼠颈动脉血栓模型、放免法测定大鼠血浆中 6 keto PGF1α和TXB2 水平。结果 :蝎毒活性多肽 (SVAPs) 0 .12 5 ,0 .2 5 ,0 .5mg·mL-1对体外凝血酶 0 .0 3μ·mL-1,ADP 10 μ·mL-1诱导的血小板聚集有明显的抑制作用 (P <0 .0 5或 0 .0 1) ,且呈量效关系。舌静脉给药 ,大鼠颈动脉血流阻塞时间延长 (P <0 .0 5或 0 .0 1)。结论 :SVAPs抗栓作用可能与其抗血小板聚集 ,升高PGI2 /TXA2

蝎毒多肽提取物促进环磷酰胺抑制Lewis肺癌的作用机制研究

目的探讨蝎毒多肽提取物增强环磷酰胺抗肿瘤的机制。方法建立小鼠Lewis肺癌皮下荷瘤模型,随机分为荷瘤对照组(模型组)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)组、蝎毒多肽提取物(polypeptideextract from scorpion venom,PESV)组和联合组(CTX+PESV组),每组10只。记录肿瘤生长曲线,并采用逆转录PCR法和免疫组织化学法检测肿瘤微环境中免疫抑制因子血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达变化,采用免疫荧光化学法检测肿瘤组织中树突细胞(dendritic cells,DCs)表型CD80、CD86的表达变化。结果连续治疗21天后,联合组Lewis肺癌移植瘤的生长明显抑制(P<0.05);与模型组相比较,PESV组中CD80、CD86的表达有所增强,而CTX组中CD80、CD86的表达有所下降,联合组与CTX组相比强度和表达量均有所增加;与模型组比较PESV组和CTX组TGF-β1和VEGF-A mRNA表达量均降低(均P<0.05);与PESV组和CTX组比较,联合组TGF-β1和VEGF-A的mRNA表达量均降低(P<0.05)。结论 PESV可抑制Lewis肺癌中VEGF-A和TGF-β1的表达,促进DC的成熟,恢复其抗原摄取提呈功能,逆转CTX对机体的免疫损伤,从而起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用。