蝶蛹金小蜂卵黄蛋白单克隆抗体的制备及其应用方法的建立

为深入研究寄生蜂卵黄发生及其内分泌调控，特采用杂交瘤细胞技术，制备4株能稳定分泌抗蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum卵黄蛋白（vitellin，Vt）的单克隆抗体（mAb），即PpVtmAb1，PpVtmAb2，PpVtmAb3和PpVtmAb4。这4株单克隆抗体的重链和轻链的亚类均分别为IgG1和κ类型，不仅特异性识别Vt，而且识别雌蜂血淋巴中卵黄原蛋白（viteUogenin，Vg），但与雄蜂体液无反应。通过比较4种不同的ELISA方法，确定了微量检测蝶蛹金小蜂体内Vg／Vt的最适ELISA法，即双夹心ELISA法。该方法可用于单头雌蜂体内Vg／Vt的检测，其检测灵敏度为20ng／mL。用Western免疫印迹的方法证实了该蜂Vg的合成始于刚羽化的成虫，并在羽化后12～36h内含量达到高峰。

蝶蛹金小蜂寄生对菜粉蝶血细胞骨架相关蛋白基因的转录调控

为揭示蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum抑制寄主菜粉蝶Pieris rapae血细胞免疫反应的分子机制,克隆了菜粉蝶肌动蛋白、肌动蛋白解聚因子及微管蛋白cDNA,并研究了蝶蛹金小蜂寄生对其转录水平的影响。结果显示:菜粉蝶肌动蛋白cDNA ORF为1131bp,编码377aa,预测分子量为41.78kDa,pI为5.29,与其他昆虫肌动蛋白的相似性非常高,在90%以上。氨基酸组成特点和系统进化分析表明,克隆到的菜粉蝶肌动蛋白基因属细胞质型肌动蛋白。菜粉蝶肌动蛋白解聚因子cDNA全长为1243bp,ORF为447bp,编码149aa,预测分子量为16.97kDa,pI为7.11,与家蚕Bombyx mori、赤拟谷盗Tribolium castaneum、意大利蜜蜂Apis mellifera和桑粉介壳虫Maconellicoccus hirsutus肌动蛋白解聚因子的相似性分别为97%,87%,89%和72%。菜粉蝶微管蛋白cDNA全长为1757bp,ORF为1344bp,编码448aa,预测分子量为50.38kDa,pI为4.86,与家蚕β型微管蛋白1,2,3和4的相似性分别为97%,97%,87%和93%。系统进化分析表明,克隆到的菜粉蝶微管蛋白基因属β型微管蛋白。RT-PCR分析表明,蝶蛹金小蜂寄生能抑制肌动蛋白、肌动蛋白解聚因子及微管蛋白基因在菜粉蝶蛹血细胞中的转录水平。由此推断蝶蛹金小蜂调控寄主血细胞骨架相关蛋白基因的转录是该蜂抑制寄主血细胞免疫反应的分子机制之一。

蝶蛹金小蜂毒液蛋白不同提取分离方法的比较

为了建立蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒液抑制寄主血细胞免疫活性组分合适的分离纯化方法,就等电点沉淀法、乙醇沉淀法、75%硫酸铵沉淀法、75%硫酸铵沉淀法+40℃加热处理法,以及75%硫酸铵沉淀法分别与3种不同滤膜的分子大小截留法的组合等7种方法对毒液蛋白分离效果及活性的影响进行了比较。结果表明:等电点沉淀法获得的组分抑制寄主菜粉蝶Pieris rapae离体血细胞延展和包囊的活性最强,乙醇沉淀法次之,75%硫酸铵沉淀法最弱。从蛋白组分的SDS-PAGE图谱来看,等电点沉淀法获得毒液组分相对最纯,仅有3条主要谱带,分子量大小在45～116.2kDa范围内;乙醇沉淀法次之,有5条主要谱带,分子量大小在24～116.2kDa范围内;硫酸铵沉淀法的谱带组成与毒液蛋白粗提液相似。3种分子大小截留法获得的毒液组分的活性分析表明,强活性组分分子量大小可能都大于100kDa。综合认为,7种方法中以等电点沉淀法提取分离蝶蛹金小蜂毒液蛋白相对为最适。

菜园常用杀虫剂对蝶蛹金小蜂存活和卵巢发育的影响

采用药膜法测定了10种菜园常用杀虫剂对蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum雌成虫存活的影响,以及其中4种杀虫剂对该蜂卵巢发育的影响.结果表明,辛硫磷和乐斯本对该蜂雌成虫的杀伤力极强,处理后2h所有个体死亡,属有害类杀虫剂;敌杀死、除尽和杀虫双处理后48h死亡率达到95%以上,表现出中等毒性;杀灭菊酯处理后48h死亡率为60.0%,为轻度有害类杀虫剂;而万灵、虫螨光和奥绿蔬虫净处理后48h死亡率均不到10%,经抑太保处理的则无个体死亡,表明四者对该蜂的杀伤力较小,均属安全杀虫剂.万灵对该蜂卵巢发育及卵子发生均有较强的抑制作用,虫螨光、奥绿蔬虫净和抑太保三者也有抑制作用,但相对较弱.从充分发挥蝶蛹金小蜂自然控制作用的角度考虑,抑太保、虫螨光和奥绿蔬虫净应是防治菜粉蝶的首选药剂.

蝶蛹金小蜂热激蛋白家族基因表达与热保护功能

作为分子伴侣,热激蛋白可起修复变性蛋白与阻止其他蛋白质聚集的作用。为进一步理解蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum热激蛋白家族的分子伴侣功能,本研究对来自该寄生蜂的热激蛋白Pphsp90,Pphsp70,Pphsc70,Pphsp60,Pphsp40和Pphsp20的基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中进行了过表达。结果表明:除Pphsp40外,其余5个基因均得到高效表达,且表达的重组热激蛋白在高温下(80℃)具可溶性与热稳定性。其中,Pphsp20与Pphsp90在大肠杆菌中的表达显著提高了高温下(50℃,1h)细胞的存活率。离体活性实验证实,利用纯化的融合蛋白Pphsp20可减少高温下荧光素酶的聚集现象。据此认为,Pphsp20与Pphsp90均具有大肠杆菌细胞的热保护功能,但Pphsp20可以单独发挥作用,而Pphsp90可能需其他因子协同作用才有保护活性。

蝶蛹金小蜂卵黄发生前后脂肪体和卵泡的超微结构

用透射电镜观察了蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum卵黄发生前后脂肪体超微结构的变化,同时观察了卵巢中不同发育时期卵泡的超微结构.卵黄发生前(蛹期)的脂肪体细胞含有大量蛋白颗粒和线粒体,但未见粗面内质网,早期蛹脂肪体细胞中可见多囊泡体;卵黄发生期(隐雌成蜂～5日龄雌成蜂)的脂肪体细胞内粗面内质网和线粒体均较为丰富.在新形成的卵泡中,卵母细胞内尚无卵黄蛋白沉积,但脂滴较多;在 级和 级卵泡中,卵母细胞中沉积有较多的卵黄体和脂滴,且 级卵泡中的卵黄体明显大于 级卵泡; 级卵泡中,卵母细胞内充满卵黄体和脂滴,并已形成卵壳.

温度和营养对蝶蛹金小蜂寿命的影响

在不同温度和不同营养条件下,测定了蝶蛹金小蜂雌、雄蜂的寿命。结果表明,35℃时雌蜂和雄蜂寿命均最短,分别为4.32 d和3.64 d;5℃时雌、雄蜂寿命均最长,分别为33.80 d和26.86 d;除35℃与30℃间差异不显著外,其他温度间均有显著差异(P=0.05)。无营养时雌雄蜂的寿命均最短,仅为6.53 d和2.71 d,饲喂40%蜂蜜水时雌蜂和雄峰的寿命最长,分别达到31.24 d和22.54 d,不同营养处理间有极显著差异(P=0.01)。5℃+40%蜂蜜水、5℃+20%蜂蜜水和20℃+40%蜂蜜水组合条件下,雌蜂的寿命较长,分别为45.83 d、44.86d和44.68d;5℃+40%蜂蜜水组合,雄峰寿命较长,为43.78 d,其次为5℃+20%蜂蜜水组合,为38.71 d。

蝶蛹金小蜂的卵巢发育在不同寄主之间差异性的比较

为明确不同寄主对蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum卵巢发育的影响,以柑橘凤蝶Papilioxuthus和菜粉蝶Pieris rapae这两种常见的寄主为研究对象,调查了两种寄主对蝶蛹金小蜂卵巢管长度、不同发育级别卵的卵室数,以及各自占整个卵巢卵室总数的比例进行了调查。结果表明,从两种寄主中羽化出的寄生蜂在卵巢管长度间差异显著,而在Ⅲ级卵的卵室比例上以柑橘凤蝶为寄主的寄生蜂明显高于以菜粉蝶为寄主的寄生蜂,而Ⅰ级和Ⅱ级的卵比例则低于后者。

3种植物提取物对蝶蛹金小蜂的触杀毒性及对其寄生效果的影响

采用药膜法,以高效氯氰菊酯为对照药剂,测定了鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr.、番荔枝Annona squamosa L.、葫蔓藤Gelsemiumelegans Benth 3种植物的氯仿萃取物对蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum L.的触杀毒性以及对产卵寄生效果的影响。结果表明,3种植物提取物对蝶蛹金小蜂成虫触杀毒性较低,处理24h死亡率分别为13.2%、8.2%、2.0%;对蝶蛹金小蜂的产卵寄生效果亦无不良影响。而化学农药高效氯氰菊酯对蝶蛹金小蜂的触杀毒性极高,处理3h死亡率达到100%,该药剂处理寄主蛹后对蝶蛹金小蜂的产卵寄生效果有较大影响,其出蜂蛹率仅为对照的1/6。

杀虫增效剂——酶抑制剂对蝶蛹金小蜂和颈双缘姬蜂的影响

采用药膜法测定了 3种酶抑制剂对蝶蛹金小蜂和颈双缘姬蜂杀虫剂敏感性的影响。结果表明 ,胡椒基丁醚、磷酸三苯酯和马来酸二乙酯显著增大了蝶蛹金小蜂和颈双缘姬蜂对甲胺磷、氰戊菊酯、氯氰菊酯、氟虫腈和阿维菌素的敏感性 ,胡椒基丁醚的作用显著高于后两者 ,而后两者之间较为接近。 2种寄生蜂对氰戊菊酯和氯氰菊酯的击倒作用具明显的恢复能力 ,而胡椒基丁醚、磷酸三苯酯和马来酸二乙酯可显著抑制这种击倒恢复能力。上述结果表明 ,2种寄生蜂对所测试杀虫剂的耐药性与多功能氧化酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽 S 转移酶的解毒作用有关 。

蝶蛹金小蜂发生规律的初步研究

蝶蛹金小蜂在信阳１年发生１３代，以幼虫在菜粉蝶蛹内越冬。１头寄主中最多出蜂１４９头，平均最高雌蜂率为９１．１％。常见１～２个羽化孔位于寄主翅膀处。雌蜂可多次与不同雄蜂交尾，能在两个以上寄主中多次产卵。雌蜂寿命长于雄蜂。有趋光性。飞行力弱。

蝶蛹金小蜂性比、寄生密度分布及两者关系的数学模拟

本文就蝶蛹金小蜂性比分布、寄生密度分布及性比和寄生密度间的关系作了数学模拟。越冬代雌性比累计频率分布呈幂函数分布,非越冬代则呈指数函数分布。越冬或非越冬菜粉蝶蛹中寄生密度累计频率分布均呈 Weibull 函数分布。越冬代和非越冬代的雌性比与寄生密度间均呈线性关系。

蝶蛹金小蜂后足胫节长用于评判其繁殖能力的探讨

蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum隶属膜翅目金小蜂科,是柑橘主要蝶类害虫如柑橘凤蝶Papilio xuthus和玉带凤蝶P. polytes,及十字花科蔬菜害虫菜粉蝶Pieris rapae等蛹期的重要内寄生蜂,分布广泛,自然寄生率高,颇具生防应用潜力.至今,有关该寄生蜂的年生活史、生物学和生态学特性,及人工释放与保护利用等方面做了一定研究.就寄生蜂人工繁育时,一般都期望得到繁殖能力高的个体.

菜粉蝶蛹血细胞体外细胞免疫反应及蝶蛹金小蜂毒液的影响

为探明蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒液对其寄主菜粉蝶Pieris rapae蛹颗粒血细胞和浆血细胞的包囊与吞噬能力的影响,本研究分别采用Na2-EDTA处理和尼龙毛法对菜粉蝶蛹颗粒血细胞与浆血细胞进行分离纯化;再采用离体细胞培养方法,研究了菜粉蝶蛹颗粒血细胞、浆血细胞各自在包囊和吞噬反应中的作用,以及蝶蛹金小蜂毒液对其所产生的影响。结果表明:颗粒血细胞和浆血细胞均参与了包囊反应,其中前者包囊作用明显,后者作用微弱,但两者同时存在时包囊作用最为明显;血淋巴浆质对颗粒血细胞和浆血细胞包囊反应均无显著影响。毒液对颗粒血细胞和浆血细胞的包囊能力均存在显著的抑制作用,且抑制作用具有明显的剂量效应特征。此外,菜粉蝶蛹颗粒血细胞和浆血细胞均具吞噬能力,其中前者吞噬能力显著强于后者;毒液对颗粒血细胞与浆血细胞的吞噬能力亦均存在显著的抑制作用,且该抑制作用亦具有显著的剂量效应特征。结果说明,菜粉蝶蛹颗粒血细胞及浆血细胞均参与寄主的细胞免疫反应,蝶蛹金小蜂毒液对其寄主颗粒血细胞和浆血细胞的包囊与吞噬能力均存在显著的抑制作用。

聚寄生性蝶蛹金小蜂雌蜂体型大小对产卵策略的影响

在寄生蜂行为生态学研究中,通常将寄主体型大小作为寄主品质的主要性状来探究寄生蜂的搜寻行为机理,而忽略寄生蜂体型大小的意义。为揭示聚寄生蜂雌蜂体型大小对其产卵决策的影响,在严格控制寄主菜粉蝶Pieris rapae蛹体型大小(体重)的情况下,于室内观察了不同体型大小的蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum雌蜂的产卵行为,并调查了子代蜂数量(窝卵数)、性比和体型大小的变化。结果表明:雌蜂在寄主上的驻留时间随其自身体型增大而缩短,但随寄主体重增大而延长。窝卵数和余卵量受到雌蜂体型大小的显著影响,均随雌蜂体型增大而显著增加(P<0.05);但子代蜂性比不受雌蜂体型大小的显著影响(P>0.05)。子代雌、雄性体型大小均与雌蜂体型大小无关,但子代雌蜂体型随寄主体重增大而增大。结果证实,雌性蝶蛹金小蜂体型大小影响其部分产卵决策。因此,在建立聚寄生蜂产卵决策模型中应考虑雌蜂体型大小这一重要变量因素。

蝶蛹金小蜂对黑纹粉蝶蛹的寄生产卵习性

通过应用高清数码摄相机手段,系统监测了蝶蛹金小蜂寄生黑纹粉蝶蛹的产卵习性。结果发现,蝶蛹金小蜂寄生黑纹粉蝶蛹的产卵过程可分为守卫、探查、产卵、整理4个阶段。蝶蛹金小蜂可以很好地寄生黑纹粉蝶蛹,暗期寄生产卵活动频次较少,光期后寄生产卵活动逐渐增加,寄生产卵活动呈现明显的昼夜节律。寄生产卵频次和时间分配主要集中在11:00—17:00,其中14:00—15:00为寄生蜂产卵高峰期。蝶蛹金小蜂寄生黑纹粉蝶蛹产卵活动频次分配率与产卵耗时分布呈正相关,单头黑纹粉蝶蛹体内产生的蝶蛹金小蜂后代数量随累计产卵时间和产卵频次增加而显著增多。随着寄主从预蛹发育到3日龄蛹,蝶蛹金小蜂单次寄生产卵耗时延长,且相对偏好选择在1日龄蛹体上寄生产卵。

两种金小蜂毒液对菜粉蝶蛹血细胞延展、存活及包囊作用的影响

活体微注射测定结果表明 ,将 0 5毒囊当量 (venomreservoirequivalent,VRE)的蝶蛹金小蜂毒液注射于其寄主菜粉蝶蛹体内 ,注射后 4～ 2 4h寄主浆血细胞和颗粒血细胞的延展、存活和对SephadexA 5 0微珠的包囊能力显著下降 ;以 0 0 0 2～ 0 0 2VRE μL的该蜂毒液处理其离体寄主血细胞均能产生同样的生理效应。该毒液抑制 90 %菜粉蝶蛹浆血细胞和颗粒血细胞延展的浓度各为 0 0 0 0 76VRE μL和 0 0 0 80 4VRE μL。可见 ,蝶蛹金小蜂毒液能显著抑制其寄主血细胞的延展和包囊作用 ,并导致血细胞的死亡。然而 ,同样条件下丽蝇蛹集金小蜂毒液对其非自然寄主菜粉蝶蛹的血细胞延展、存活和包囊作用则无任何效应。可见 ,寄生蜂毒液的生理作用具有明显的寄主特异性。

菜粉蝶蛹体型大小对蝶蛹金小蜂后代数量、性比及体型大小的影响

为检验"寄主体型大小-质量假说",采取饥饿方法处理菜粉蝶(Pierisrapae)高龄幼虫,以获得体型大小(用体质量表示)差异大于同一自然地理种群内个体间差异的寄主蛹,然后供聚寄生蜂-蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)寄生,观察寄生蜂在不同大小寄主蛹内的后代数量、性比以及体型大小。结果表明,蝶蛹金小蜂1次攻击产出的后代蜂数随寄主蛹体质量增加而显著增多,蛹中平均出蜂314.97头.g-1。蝶蛹金小蜂后代的雌性比例随寄主蛹质量的增大而显著提高,后代雌蜂和雄蜂的体型大小(后足胫节长度)均随寄主蛹质量的增大而显著增大。可见,蝶蛹金小蜂母蜂能够根据寄主蛹质量来调整后代数量和性比,以使后代适应度最大化。最后,就蝶蛹金小蜂产卵策略及其影响因素进行了讨论。

蝶蛹金小蜂寄生对菜粉蝶和玉带凤蝶蛹血细胞数量和组成的影响

以血球计数板较系统地考查了菜粉蝶和柑桔凤蝶雌雄蛹被蝶蛹金小蜂寄生后浆血细胞和颗粒血细胞数量的时间动态变化,以明确该蜂寄生对其寄主血细胞数量和组成的影响。结果表明,菜粉蝶蛹被寄生后,其血细胞总数除寄生后2天外均极显著高于同期未寄生蛹,最多的约高出20倍;除被寄生后0.5和5天的寄生蛹的血细胞组成与同期未寄生蛹无显著差异外,寄生后1～4天雌雄寄生蛹的浆血细胞所占比例均显著低于同期未寄生蛹,而颗粒血细胞所占比例则反之。玉带凤蝶寄生蛹的血细胞总数在寄生后0.5～3天与同期未寄生蛹相比均无显著差异,但寄生后4～5天却显著升高,最多的约高出3倍;寄生后0.5～5天的寄生蛹浆血细胞所占比例均显著低于同期未寄生蛹,而颗粒血细胞所占比例恰反之。可见,该蜂寄生在一定时间内不仅能引起其两种寄主血细胞总数和颗粒血细胞所占比例明显增高,而且能导致浆血细胞所占比例明显下降。

成虫营养和交配对蝶蛹金小蜂卵巢发育与卵黄发生的影响

为明确不同因子对蝶蛹金小蜂雌蜂生殖生理的影响,采用ELISA法测定血淋巴中卵黄原蛋白(Vg)和卵巢内卵黄磷蛋白(Vt)的含量,研究成虫取食蔗糖和蜂蜜水及提供雄蜂交配对该蜂卵巢发育和卵黄发生的影响。结果表明,该蜂卵巢在羽化后24h内发育较慢,卵巢管内无成熟卵,而在羽化24h后卵巢快速发育,卵巢管内出现成熟卵。雌蜂取食蜂蜜水,血淋巴中Vg含量在羽化后72h达到最高,约为0.78μg,同时卵巢内Vt含量也达到最高,约为5.8μg。雌蜂取食蔗糖水,血淋巴中Vg含量在羽化后30h达到最高,约为0.62μg,卵巢内Vt的含量在羽化后96h达到最高,约为5.6μg。而对照雌蜂(取食蒸馏水)血淋巴中Vg含量在羽化后24h达到最高,约为0.58μg,卵巢内Vt含量在羽化后48h达到最高,约为4.5μg。此外,取食蔗糖水可以延长雌蜂寿命并促进卵巢发育,但对Vg的合成与摄取均无显著影响;取食蜂蜜水,不仅能延长雌蜂寿命,还对卵黄发生和卵巢发育起显著促进作用,尤其在卵黄发生的后期,达极显著水平。交配未能显著促进该蜂的卵黄发生。