HBV与HCV融合基因免疫的抗肿瘤作用研究

目的 :观察基因疫苗SpcDNA3.1、CpcDNA3.1及融合基因疫苗CSpcDNA3.1诱导BALB c小鼠 (H 2 d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg和HCcAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞 (H 2 d)接种动物后成瘤性的影响。方法 :3种重组质粒SpcDNA3.1、CpcDNA3 1和CSpcDNA3 1分别肌注免疫小鼠 ,3w后背部皮下接种质粒CSpcDNA3 1转染的P815细胞 ,观察小鼠成瘤和存活时间。LDH法检测免疫小鼠的脾淋巴细胞CTL活性。结果 :融合质粒CSpcDNA3 1可显著抑制肿瘤出现和生长 ,小鼠生存时间明显延长 ,生存率提高 ,CSpcDNA3 1免疫的小鼠脾淋巴细胞体外对转染的P815肿瘤细胞有明显的杀伤作用。结论 :融合基因疫苗CSpcDNA3 1免疫的小鼠能诱发特异性抗肿瘤细胞免疫。

HBV S基因与HCV C基因融合基因免疫与联合基因免疫效果研究

目的比较HBV S基因与HCV C基因真核表达质粒融合基因免疫与联合基因免疫的效果，为HBV和HCV融合基因疫苗研究奠定基础。方法将同时含HBV S基因与HCV C基因的真核表达质粒SCpcDNA3.1、含HBVS基因真核表达质粒SpcDNA3.1、含HCV C基因真核表达质粒CpcDNA3．1分别免疫小鼠；将SpcDNA3.1+CpcDNA3.1联合免疫小鼠。ELISA法检测血清抗HBs和抗HCV。结果无论是抗HBs和抗HCV阳转出现的时间、阳转率和体液免疫应答强度，融合基因免疫都优于联合基因免疫：融合基因免疫的抗HBs的应答强度低于SpcDNA3．1质粒的免疫，抗HBc的应答强度高于CpcDNA3.1质粒的免疫。结论HCV C基因或其表达产物对HBV S基因或抗原的表达和提呈有抑制作用；HCV C基因与HBV S基因相融合，更有利于HCV核心蛋白的提呈。

问号钩端螺旋体属lipL32/1-ompL1/1融合基因的真核表达及其表达产物的免疫反应性

目的 :构建问号钩端螺旋体 (简称钩体 )的融合基因 lip L32 / 1- omp L1/ 1真核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性。方法 :采用连接引物 PCR构建融合基因 lip L32 / 1- omp L1/ 1,克隆测序后构建 lip L32 / 1- omp L1/ 1的毕赤酵母真核表达系统 p PIC9K- lip L32 / 1- omp L1/ 1- P.pastoris GS115。用 MM和 MD平板分离 His+ Mut+型菌落 ,YPD平板筛选出 G4 18高抗性的 His+ Mut+ 转化子。以酵母裂解酶处理的高拷贝转化子 His+ Mut+ 克隆裂解产物为模板 ,5 'AOX1和 3'AOX1为引物 ,用 PCR检测所构建的毕赤酵母工程菌株染色体 DNA中的目的融合基因。在 BMMY培养基中用甲醇诱导目的重组蛋白 r L ip L32 / 1- r Omp L1/ 1表达。采用硫酸铵沉淀 ,Ni- NTA亲和层析提纯培养物上清液中的 r L ip L 32 / 1- r Omp L1/ 1。采用 SDS- PAGE和 Western blot分别检测 r L ip L 32 / 1- r Omp L 1/ 1的产量及其免疫反应性。结果 :获得的 lip L32 / 1- omp L1/ 1融合基因约为 1794 bp。其核苷酸和氨基酸序列与原始lip L32 / 1和 omp L1/ 1基因型比较 ,相似性分别高达 99.94 %和 10 0 %。所构建的真核表达系统可分泌 r Lip L32 / 1-r Omp L1/ 1,SDS- PAGE后位于预期位置处 ,产量约占上清总蛋白的 4 0 %。r Lip L32 /

丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。

问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL41/1融合基因原核表达系统的构建及其应用

目的 :构建问号钩端螺旋体 (简称钩体 ) lip L 32 / 1- lip L 4 1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,了解钩体野生株 lip L32和 lip L4 1基因携带和表达情况及钩体患者的血清抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lip L32 / 1- li-p L4 1/ 1融合基因 ,常规方法构建其原核表达系统。采用 SDS- PAGE检测目的重组蛋白 r L ip L32 / 1- r L ip L4 1/ 1表达情况。采用 Western blot鉴定 r Lip L32 / 1- r Lip L4 1/ 1的免疫原性。采用 PCR和 MAT分别检测 97株问号钩体野生株 lip L32和 lip L4 1基因及其表达情况。采用 EL ISA检测 2 2 8例钩体患者血清 lip L32和 lip L4 1基因产物的抗体。结果 :与报道的相关序列比较 ,lip L 32 / 1- lip L 4 1/ 1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为 99.9%和99.8%。目的重组蛋白 r Lip L32 / 1- r Lip L4 1/ 1表达产量约为细菌总蛋白的 10 % ,主要以包涵体形式存在。r L ip L32 /1和 r Lip L4 1/ 1兔抗血清均能与 r L ip L32 / 1- r L ip L4 1/ 1结合。 97.9%和 87.6 %问号钩体野生株分别有 lip L32和 li-p L4 1基因。95 .9%和 84 .5 %问号钩体野生株分别与 r Lip L32 s和 r Lip L4 1s兔抗血清出现效价 ,为 1∶ 4～ 1∶ 12 8的MAT阳性结果。分别有 94 .7%～ 97.4 %和 78.