Pina和Pinb融合基因表达载体的构建及其在硬粒小麦中的转化

【目的】构建Pina、Pinb融合基因表达载体,验证Pina和Pinb基因的功能,为利用转基因技术改良小麦籽粒质地提供理论依据和基础材料。【方法】以软质小麦京411作为Pina和Pinb基因的供体,将Pina、Pinb基因融合后,与基础质粒pG4AB上的Ω和poly(A)等增强基因表达的调控序列及pAHC25上的Ubiqutin启动子和bar基因表达盒相连接,构建Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体。利用基因枪转化硬粒小麦幼胚,并对硬粒小麦幼胚再生体系进行探索。【结果】在构建完成Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体pFUBPaPb的基础上,转化硬粒小麦幼胚16000多枚,经biolaphos筛选、PCR鉴定和斑点杂交鉴定,得到再生植株2390株,35株为阳性植株。共得到T1代籽粒356粒,对种子量较多的16个单株籽粒进行蛋白表达分析,有2株检测到基因表达产物,其籽粒SKCS硬度值比受体品种分别降低了10和12。培养基SD2适于硬粒小麦幼胚愈伤组织的诱导,MS+8mg·L-1玉米素可获得较为理想的再生频率。【结论】Pina和Pinb的共同表达降低了硬粒小麦籽粒硬度,具有软化籽粒质地的功能。

嗜水气单胞菌外毒素和外膜蛋白双基因融合表达载体的构建和高效表达

用基因融合方式 ,以嗜水气单胞菌基因组DNA为模板 ,设计引物通过聚合酶链式反应 (PCR)把去除部分毒性活性编码区的细胞毒肠毒素基因 (act)与去除信号肽的外膜蛋白基因 (OmpTS)连接一起 ,两基因之间插入一个link er(Gly4Ser) 3 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,得到 2 .1kb的双基因融合片段 ,克隆于表达质粒pQE 30中 ,构建了双基因重组表达载体pQE30 /act GS ompTS ,转化大肠杆菌M15 (pREP4 ) ,经IPTG诱导 ,表达出预期大小 (81.0kD)的融合蛋白Act GS OmpTS ,此蛋白占菌体总蛋白的 4 2 %。Westernblot检测结果显示 ,该蛋白与抗Act兔血清和抗OmpTS兔血清都呈阳性反应 ,表明融合蛋白保留了外毒素和外膜蛋白的反应原性 。

牛瑟氏泰勒虫P23和P33表面蛋白双基因融合表达载体的构建及原核表达

为探索牛瑟氏泰勒虫的表面蛋白基因融合产物作为双价疫苗的可行性,以牛瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应(SOE-PCR)把P23和P33表面蛋白基因连接一起,2个基因之间插入一个linker(Gly4Ser)3,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得1151bp的双基因融合片段,克隆于表达质粒pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-P23-P33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小70.0ku的融合蛋白。Western blot检测结果显示,该蛋白与牛瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据。

PSP94-TNFαD11a融合基因在NIH3T3细胞中的表达及其产物活性分析

为了分析 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的表达和表达产物的生物学活性 ,将含该融合基因的质粒 pc DNA- PSP94- TNFα D1 1 a转染 NIH3T3细胞 ,72 h后收集细胞培养上清 ,并提取细胞总RNA,经 RT- PCR,得到与目的基因长度相符合的 c DNA片段 ;以 PSP94c DNA为探针 ,对 RT-PCR产物进行 Southern印迹分析 .结果表明 :转染 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的 NIH3T3细胞 ,其 RT- PCR产物杂交信号为阳性 .细胞培养上清用 TNF抗体行 Western印迹和 ELISA分析 ,检测结果为阳性 .生物学活性分析表明 ,细胞培养上清不仅具有 PSP94抑制人前列腺癌细胞 PC- 3生长的活性 ,而且显示出 TNFα对 L92 9细胞的细胞毒作用 .以上结果表明 ,pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a质粒能够正确表达目的基因 PSP94- TNFα D1 1 a,且表达的 PSP94- TNFαD1 1 a融合蛋白具有预期的双重生物学活性 .

抑制MLL-AF9融合基因表达对急性单核细胞白血病THP-1增殖的影响

目的研究 siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病 THP-1的 MLI-AF9融合基因的影响。方法选择 THP-1细胞特有的 MLL-AF9 融合基因为靶基因,设计并合成 siRNA 片段。以人急性单核白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将 siRNA 导入细胞。通过 Hoechst33258染色观察 siRNA 作用于 THP-1中出现凋亡小体的情况,流式细胞仪检测细胞周期的改变,

非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因1型的表达研究

目的:检测广西非小细胞肺癌癌组织中EML4-ALK融合基因1型的表达水平并探讨其临床意义。方法:运用两步法RT-PCR技术。检测来自于我院81例非小细胞肺癌癌组织和17例支气管扩张或肺大疱等手术切除的非癌肺组织中EML4-ALK融合基因1型的表达水平。结果:81例非小细胞肺癌癌组织和17例非癌肺组织中分别检测出26例(32.10%)和14例(82.35%)EML4基因表达阳性,全部标本中EML4-ALK融合基因1型表达阴性。结论:在广西非小细胞肺癌患者癌组织标本中未检测出EML4-ALK融合基因1型的表达,可能是EML4-ALK融合基因1型在非小细胞肺癌中的表达具有区域异质性。

人防御素hβD-3基因在大肠埃希菌中的融合表达

研究了人类防御素hβD-3基因在大肠埃希菌细胞中的融合表达,采用pET-32a(+)载体在BL21(DE3)溶原菌中进行了F-βD-3蛋白的融合表达.结果表明,F-βD-3蛋白的表达量达到127.23μg/mL,融合蛋白经镍柱亲和层析与肠激酶酶切后,最终得到hβD-3蛋白的量为18.17μg/mL.经对大肠埃希菌K12D31的抑菌试验鉴定,肠激酶酶切后产物为有抑菌活性的重组hβD-3蛋白.

人钠/二羧酸协同转运蛋白1基因融合表达及其抗体制备

利用DNA重组技术 ,将编码人钠 羧酸协同转运蛋白 1(hNaDC1)抗原表位区 (W138 Q2 19)的cDNA克隆至融合表达载体pGEX 5X 1,构建重组质粒pGEX hNaDCL6 .在大肠杆菌BL2 1中 ,经IPTG诱导 ,获得谷胱甘肽巯基转移酶 (GST) hNaDC1重组融合蛋白的表达 .以谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,获得纯化的GST hNaDC1.以此为免疫原制备的抗hNaDC1抗体可特异性识别人类和大鼠肾组织以及小肠组织中天然的钠 二羧酸协同转运蛋白 1.利用该抗体 ,首次证实了hNaDC1基因编码产物分布于人肾组织近端肾小管刷状缘 ,与大鼠钠 二羧酸协同转运蛋白 1(SDCT1)分布一致 .

弓形虫主要表面抗原基因编码序列的扩增、克隆及原核融合表达

目的扩增弓形虫主要表面抗原（P30）基因编码序列并进行重组表达方法设计合成引物，从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因编码序列，克隆入载体pGEM-T和PGEX-4T-1，经PCR和酶切筛选，测序验证后，进行诱导表达和Westemblot鉴定结果从弓形虫基因组DNA中扩增出P30基因编码序列，并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P30结论P30克隆载体和GST融合表达载体的构建和P30的成功表达，为进一步从基因水平和蛋白水平研究P30及进行诊断试剂和疫苗研究创造了条件。

重组人β趋化因子RANTES基因融合表达产物活性分析

为研制基于病毒受体的抗艾滋病毒感染基因药物 ,将重组人 β趋化因子RANTES基因导入大肠杆菌中表达谷胱甘肽S 转移酶 (GST) RANTES融合蛋白 ,并回收携带末端延伸肽 (TEP)的RANTES修饰蛋白 .荧光免疫化学分析表明 ,2种非天然RANTES蛋白均显示对人外周血淋巴细胞的结合活性 .暗示在细胞表面可能已发生RANTES与CCR5之间的相互作用 .2种修饰RANTES蛋白都能使人外周血细胞的过氧化物酶活性显著升高 ,提示这 2个人造蛋白可能仍存在对淋巴细胞的趋化性诱导 .

人胰岛素突变体基因的融合表达

目的 以 pTXB1作为融合表达载体 ,构建人胰岛素突变体 (M insulin)的基因表达克隆 ,表达及纯化。 方法 基因合成胰岛素突变体的cDNA序列 ,酶切后装入融合表达质粒 pTXB1,基因测序正确后转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,诱导表达 ,初步纯化。结果 融合蛋白的分子量约为 330 0 0 ,表达量占菌体总蛋白的 5 0 %以上。融合蛋白主要以包涵体的形式存在 ,洗涤包涵体后融合蛋白的纯度达到 85 %以上。Western blot表明表达蛋白具有胰岛素抗原活性。活性测定显示 ,每升诱导培养后的菌液表达产物中 ,具有的放射免疫活性为 0 .5U。结论 成功地构建了人胰岛素突变体的融合表达体系 ,为进一步的研究奠定了基础。

融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析

目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。

痢疾菌体内诱导基因表达文库的构建

目的构建筛选痢疾菌福氏2a体内诱导基因的融合基因表达文库。方法以自杀载体pGP704为骨架,用氯霉素乙酰转移酶基因作为报告基因,构建了用于筛选体内诱导基因的载体pGP-cat。把痢疾菌福氏2a基因组DNA的随机酶切片段0.6-1kb亚克隆到pGPcat载体报告基因上游的BglⅡ位点,构建了融合基因文库。结果与痢疾菌福氏2a2457T结合转移后,获得融合基因表达文库。以氯霉素为选择标记,经过体外初步筛选,得到3.2%的具有氯霉素抗性的菌株。结论构建的融合基因表达文库适用于筛选福氏2a痢疾菌的体内诱导基因。

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST p16融合蛋白。方法 以质粒pM p16为模板 ,扩增出p16基因片段 ,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX 6P 1,将所构建的重组质粒pGEX p16转化大肠杆菌BL2 1并诱导表达 ,采用GST蛋白纯化系统进行纯化 ,所得产物进行SDS PAGE及Westernblot鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约 4 2kD蛋白 ,其分子量与GST p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16抗体特异性识别。结论 本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST

Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因表达文库的构建

为构建用于筛选Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因的融合基因表达文库。采用自杀载体pGP704为骨架，将无启动子的cat基因作为报告基因克隆到自杀载体pGP704上，构建报告质粒pGPT04-cat将Ⅱ型猪链球菌基因组DNA的500～1000bp酶切片段克隆到报告质粒pGP704-cat中cat基因的上游，转化受体菌获得融合基因文库；将文库质粒电转化Ⅱ型猪链球菌，得到融合基因表达文库。结果表明：构建的融合基因表达文库以氯霉素作为选择标记，经体外培养，获得2％的菌株具有氯霉素抗性，融合基因表达文库存在可以启动cat基因表达的启动子序列，cat基因在体外可以表达。构建的融合基因表达文库可以用于Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因的筛选。

人β防御素3基因在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达

根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性和β防御素3全基因中G、C、A、T含量的平衡,设计搭桥引物,通过PCR法合成人β防御素全基因序列,克隆到真核表达载体pPICZα-A,测序确认.将重组体电击转化酵母GS115.转化子经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性.结果表明,目的基因在毕赤酵母中已得到表达,表达量为0.22 mg/mL,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抑菌活性.

果蝇抗菌肽基因(Andropin)的原核表达与活性分析

【目的】克隆果蝇抗菌肽Andropin基因,以期利用原核表达系统生产高活性抗菌肽。【方法】首先化学合成了目的基因的2个片段和1对引物,然后利用重叠区互补PCR法得到抗菌肽Andropin的全基因序列。构建了融合表达载体pET32a-Anp,并转入感受态细胞OrigammiB进行原核融合表达。重组菌株诱导表达后,用His-Tag Purification kit亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的蛋白用肠激酶切割并进行活性分析。【结果】在诱导温度37℃、1mmol/LIPTG诱导培养4h的条件下,可获得高效表达的融合蛋白;融合蛋白的表达量占总蛋白的30%,分子质量约为28ku,可溶性达70%以上;抗菌活性试验表明,表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。【结论】重组工程菌表达得到Andropin的融合抗菌肽,且其具有抗菌生物学活性。

IL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒联合HBV DNA疫苗治疗HBV转基因小鼠效果评价

目的评价融合蛋白基因质粒(pFP)联合在体电脉冲(EP)介导的HBVDNA疫苗(pS2.S)免疫HBV转基因(Tg)小鼠的治疗效果。方法HBVTg小鼠随机分成3组,每组5只,分别为pS2.S+pFP、pS2.S+pcDNA3.1免疫治疗和pcDNA3.1对照组,联合免疫质粒总剂量40μg/只,按1∶1比例混合接种。初次免疫后第4、8周分别进行第一、二次增强免疫,免疫前后分别检测血清学、组织学及HBV特异性免疫应答。结果HBVDNA血清定量检测结果,pS2.S+pFP组免疫第8周(13317±2539)拷贝/ml、第12周(6462±3359)拷贝/ml时分别较免疫前(36159±7769)拷贝/ml明显减低,差异具有统计学意义(P<0.01);pS2.S+pcDNA3.1组第4周(20618±9523)拷贝/ml及第8周(23818±5319)拷贝/ml时均较其免疫前水平(36090±4421)拷贝/ml明显降低(P<0.01),但不能持续到12周(27691±13071)拷贝/ml,并明显高于此时pS2.S+pFP组水平,差异有统计学意义(P<0.01);观察终点(12周)pS2.S+pFP组Tg小鼠个体血清HBVDNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的升高。结论Th1类细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白基因表达质粒能够增强HBVDNA疫苗抑制Tg鼠HBVDNA复制和表达的治疗作用。

In-fusion技术构建表达、纯化钠泵α3亚单位膜外区截断性片段重组质粒

目的构建重组pGEX-6P-1原核表达载体，表达和纯化大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区的截断性片段。方法利用In-fusion技术将钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区基因片段插入线性化的pGEX-6P-1载体中，转化，提取质粒，PCR鉴定；用阳性重组质粒pGEX-Trf-α3转化大肠杆菌，IPTG诱导、表达融合蛋白GST—Trf-α3。采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性及含量。采用放射性配体结合法检测其生物活性。结果PCR和基因测序分析显示大鼠钠泵a3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区被成功插入pGEX-6P-1载体GST基因3’端，蛋白序列分析表明GsT-Trf-α3融合蛋白总长度262个氨基酸，理论相对分子质量应约为33．22×10^3。IPTG诱导后，GST-Trf-α3融合蛋白的表达量为10％，多以可溶性形式存在，可溶性蛋白表达量为80．8％。SDS-PAGE结果显示其纯度〉95％。生物活性实验结果显示GST—Trf-α3融合蛋白与^3H-哇巴因具有一定的结合能力，但结合能力较弱。结论采用In-fusion技术成功构建了表达GST-Trf-α3融合蛋白的原核表达载体，建立了纯化方法，获得高纯度的融合蛋白，为钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区功能以及其潜在的药理学作用研究获得了实验数据。