牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌((Bifidobacteria bifidum,Bb)-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接(gene SOEing)法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。

牛结核杆菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表达及抗原反应性分析

为增强单个蛋白的抗原性,利用(Gly4Ser)3柔性连接肽将牛结核杆菌MPB70和ESAT-6融合。采用重叠延伸PCR技术将牛结核杆菌mpb70与esat-6基因连接,获得融合基因mpb70-esat-6,连接至T-Vector pMD19中,获得克隆质粒pMD-70-esat-6。经Bam HⅠ、EcoRⅠ酶切、纯化,并与p ET28a(+)载体连接,构建了pET-70-esat-6重组表达质粒。SDS-PAGE发现,在27.2 ku处表达了融合蛋白MPB70-ESAT-6,Western blotting证实,MPB70-ESAT-6与牛结核阳性血清反应性良好。MPB70-ESAT-6融合蛋白的研究为牛结核病诊断抗原及相关疫苗研究奠定了基础。

结核杆菌CFP-10／ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。

牛分支杆菌ESAT-6/Ag85B/Mtb8.4基因与牛IL-2基因融合表达

本研究拟制备牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因的融合蛋白。从患结核病鹿的肺组织中分离牛分支杆菌并提取基因组DNA,PCR扩增牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;提取牛淋巴细胞,经总RNA提取、RT-PCR得到了IL-2基因片段。经测序鉴定后,将4个目的片段重组,构建原核表达载体,并对表达的融合蛋白进行鉴定。克隆出了牛IL-2,以及牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;构建了原核表达载体pME290-SDCZ,并表达出了融合蛋白;Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗牛分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。制备了牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4融合蛋白,本研究为下一步研制重组牛结核亚单位疫苗奠定了基础。

三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用

目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT84和MPT63-MPT70重组蛋白抗体,探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63- MPT70免疫血清,制备包被抗体和标记抗体,建立检测3种蛋白的双抗体夹心法,并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测。结果CFP10-ESAT-6的最低检出浓度为25 ng/mL,MPT64和MPT63-MPT70均为50 ng/mL。CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液,只有结核分枝杆菌为阳性;而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外,还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果。CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33.9%、41.2%和47.9%;检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1.8%、7.1%和10.7%;检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3.1%和7.8%。结论CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高,但特异性较好。