ADAM12(融合素-α)基因研究

解整合素 金属蛋白酶 (ADAM)是一新近发现的细胞膜结合糖蛋白家族。ADAM1 2又称融合素 α(meltrin α)。融合素 α参与肌母细胞融合和肌管形成。骨母细胞在分化过程中也表达融合素 α ,表明融合素 α参与骨的形成。培养的人RD横纹肌肉瘤和HU 1肺腺癌细胞株表达融合素 α ,但表达水平较胎盘低。融合素 α的基因和蛋白质结构从N 末端到C 末端依次为前结构域、金属蛋白酶结构域、解整合素样结构域、富半胱氨酸结构域、跨膜结构域、胞浆结构域。

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖。本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响。方法:将含有mfn2cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Westernblot法检测绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化。结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP。MTT实验提示转染mfn2cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2±2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P<0.05)。mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6±4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4±2.8)%(P<0.05)。结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性。

线粒体融合素基因-2与肿瘤

线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,Mfn-2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,在维持线粒体的形态、功能等方面起着重要作用。随着研究的不断深入,Mfn-2在细胞信号转导、能量代谢、增殖及凋亡等生命过程中的作用日益显现。而肿瘤发生与细胞过度增殖及凋亡不足等密切相关,因此,如何抑制肿瘤细胞的过度增殖和促进细胞凋亡已成为目前的研究热点。Mfn-2通过多条通路参与多种肿瘤传代细胞系的增殖和凋亡,其表达异常或功能缺失可能是肿瘤发生、发展的重要原因。Mfn-2在许多肿瘤组织中低表达,且表达情况与肿瘤病理类型及生物学行为密切相关,提示其有可能是新的抑癌基因;同时,Mfn-2过表达与喜树碱、放线菌酮(cycloheximide,CHX)等化疗药物联用具有协同作用,提示具有成为化疗增敏靶点的潜力。本文就Mfn-2的功能与肿瘤发生、发展的关系及其治疗学意义的相关研究进展进行综述。

线粒体融合素-2对裸鼠移植瘤Ki-67、血管内皮生长因子的影响

目的:探讨瘤内注射vivo-jetPEITM/pEGFP Mfn2复合物对裸鼠移植瘤增殖的影响。方法:质粒pEGFPMfn2的构建及检测,将MCF-7细胞异种移植到裸鼠体内,建立人乳腺癌移植瘤模型,用vivo-jetPEITM试剂制备vivo-jetPEITM/DNA复合物,实验共分为实验组、空载体对照组和空白对照组。瘤内多点注射,RT-PCR检测肿瘤组织线粒体融合素-2(Mfn2)的表达,免疫组化检测Ki-67、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:pEGFPMfn2构建成功并测序证实,实验组的相对平均吸光度值为(1.12±0.05)高于空载体对照组的(0.16±0.05)和空白对照组(0.17±0.07)(P<0.05),Ki-67在实验组的相对平均吸光度为(0.25±0.06)高于空载体对照组的(0.11±0.02)和空白对照组(0.12±0.03)(P<0.05),而VEGF在实验组的相对平均吸光度为(0.09±0.01)低于空载体对照组的(0.14±0.08)和空白对照组的(0.13±0.03)(P<0.05)。结论:vivo-jetPEITM试剂能成功将Mfn2基因转染进瘤体细胞,Mfn2基因对人乳腺癌裸鼠移植成瘤后的Ki-67和VEGF有影响。

线粒体融合素基因-2对乳腺癌细胞RECK基因表达的影响

目的探讨线粒体融合素基因-2(mfn2)对乳腺癌细胞株MCF-7细胞中RECK表达的影响。方法利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFP-mfn2转染MCF-7细胞。RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因mRNA的转录水平;Weastern blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达。结果转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达mfn2,RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达,转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高。结论mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达。

毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白发酵条件的优化

能分泌表达重组人溶菌酶-鲎素融合蛋白的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌(X33/pPICZαA-human lysozyme-TachyplesinⅠ构建的)。除了基因本身内在特性外,表达条件对外源基因的表达量也有着极显著的影响。本文在摇瓶水平上通过发酵液起始pH、甲醇诱导浓度、诱导时间这3个因素进行表达条件优化。通过生长曲线,Bradford检测以及平板扩散试验分析,获得摇瓶发酵表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白的最佳条件为发酵液初始pH 5.0,甲醇诱导浓度为2.0%,诱导时间为72 h;Bradford检测法分析显示表达量最高,平板扩散试验显示融合蛋白对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)抑菌能力最明显,为进一步大规模发酵表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白奠定了基础。

抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建与表达

目的:探讨抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建效果与抗凝溶栓活性表达情况。方法:在间接实验中,选择p BV-重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质质粒进行酵母大量表达,再进行两级纯化分析;去纯化的单位进行抗凝溶栓的检测。结果:工程菌酵母发酵培养诱导1 h后就可以检测到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,表达量随发酵时间的增加而递增。两级纯化的重复性非常好,纯度经RP-HPLC测定在98%以上。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的溶栓活性明显高于水蛭素与葡激酶的单纯溶栓活性(P<0.05)。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有更强的纤溶酶原激活活性,明显高于水蛭素与葡激酶的单纯纤溶酶原激活活性(P<0.05)。结论:重组葡激酶-水蛭素融合蛋白生产工艺具有很好的诱导与纯化效果,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白能发挥较好的抗凝与溶栓作用。

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环抗凝溶栓中的应用比较

目的：探讨与比较抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环中的应用优势。方法2013年2月～2014年7月，选择镍钛合金片分成未包被组（A 组）、基础包被组（壳聚糖，B 组）、壳聚糖／葡激酶（C 组），壳聚糖／水蛭素（D 组）、壳聚糖／重组葡激酶-水蛭素融合蛋白（E 组），纳入新鲜全人血中进行溶血实验，计算溶血率与血细胞状况。同时健康新生儿脐静脉内皮细胞植入各组别的镍钛合金片，进行细胞相容性实验。结果5组样品溶血率在1.5％左右，5组的红细胞、白细胞和血小板数量均在正常范围内，各组比较差异均无统计学意义（P ＜0.05）。E 组的增殖程度与黏附程度都明显低于其他4组，对比差异明显（P ＜0.05）；A 组与 B 组的相关比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。随机双盲法细胞计数结果示 C，D 与 E 组与 A，B 组比较差异有统计学显著性意义（P ＜0.05），同时 E 组与 C，D 组对比差异也有统计学意义（P ＜0.05）。结论相对于葡激酶与水蛭素的单独应用，重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环中的应用能发挥更强的抗凝、抗血栓作用，安全性好，从而确保心血管疾病介入治疗的有效性。

线粒体融合素基因-2对人骶韧带成纤维细胞增殖及功能的影响

目的：研究外源性线粒体融合素基因-2（Mfn2）表达对骶韧带成纤维细胞的增殖及其合成前胶原蛋白功能的影响。方法：取新鲜骶韧带组织，用组织块法在体外培养出成纤维细胞。将第2～4代细胞分组：转染LV-Mfn2-GFP组（Mfn2＋组），转染LV-GFP组（Mfn2-组）和未转染组（对照组）。流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达，RT-PCR和Western blot检测Mfn2表达。细胞计数和cck-8法检测Mfn2对细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞周期分布。RT-PCR和Western blot检测细胞前胶原1 A1/1A2/3A1的表达。结果：转染慢病毒的成纤维细胞GFP蛋白表达率73.2％～79.1％，转染Mfn2＋组成纤维细胞稳定高表达Mfn2蛋白，显著高于Mfn2-组和对照组（P＜0.05，both）。cck-8实验提示，转染表达Mfn2基因96h后，成纤维细胞增殖明显受到抑制，Mfn2＋组细胞数显著低于 Mfn2-组和未转染组（P＜0.05 both）；DNA直方图分析法测定显示转染Mfn2基因的细胞大部分停滞于G0/G1期，Mfn2＋组G0/G1期细胞比例（60.7％±3.26％），显著高于 Mfn2-组（43.2％±3.32％）和对照组（40.8％±2.28％），（P＜0.05， both）。半定量RT-PCR和Western blot示Mfn2＋组成纤维细胞合成表达前胶原1A1/1A2/3A1显著低于Mfn2-组和对照组（P＜0.05，all）。结论：Mfn2基因在体外转染成纤维细胞后，抑制细胞增殖并使成纤维细胞前胶原蛋白表达下降，可能是导致骶韧带细胞外基质减少，影响韧带纤维数量和质量的重要原因。

人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定

目的:为解决类风湿性关节炎中骨破坏及炎症损伤两大难题,拟克隆人骨保护素功能区与分枝杆菌热休克蛋白70肽段融合基因,进一步观察其在大肠杆菌中的表达并鉴定活性。方法:实验于2006-05/2007-09在首都医科大学免疫学系实验室完成。采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨肉瘤细胞系MG63总RNA中扩增骨保护素成熟肽段编码区基因,构建pGEM-TEasy-骨保护素重组质粒。以此为模板,聚合酶链反应扩增骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA,构建重组表达载体pET-28a-骨保护素-热休克蛋白70,将其转化E.coli.BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷诱导后收集菌体蛋白,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹鉴定该融合蛋白的表达,以破骨细胞生长抑制实验及抑炎实验检测该融合蛋白的生物学活性。结果:①实验最终获得人骨保护素全长基因片段,人骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA片段已被正确插入到pET-28a载体中,转化菌株可表达人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白。②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示约在Mr22000处有蛋白的超表达,而未诱导菌株未发现有此条带。③蛋白免疫印迹检测表明,融合蛋白能与抗人骨保护素单克隆抗体特异性结合。④破骨细胞生长抑制实验表明,该融合蛋白能够减少破骨细胞的生成数量,具有体外抑制骨破坏的生物活性。⑤抑炎实验表明,融合蛋白具有显著减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应程度的作用,说明融合蛋白中热休克蛋白70具有抑制炎症的生物学活性。结论:在E.coli.BL21(DE3)中表达了骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白,体外功能实验证实该融合蛋白具有一定的生物学活性。

基于音节-形态素融合的朝鲜语命名实体识别研究

命名实体识别任务是朝鲜语自然语言处理研究过程中最重要的基础任务之一。针对朝鲜语命名实体识别的边界划定不明确和准确率低等问题,该文提出基于Transformer的音节-形态素融合的朝鲜语命名实体识别模型。首先通过BERT预训练模型分别对音节和形态素进行词嵌入;其次使用两种不同的向量融合方法将音节向量和形态素向量相融合,即简单的向量拼接方法和考虑到向量联系与差异的启发式融合方法;最后将融合后的向量作为模型的输入完成命名实体识别任务。实验结果在KLUE公布的朝鲜语命名实体识别数据集中F1值达到了88.78%,相比单一粒度实验提高约3至4个百分点。

Mfn2基因过表达对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及EGFR、EGF蛋白表达的影响

目的通过使人乳腺癌MCF-7细胞过表达线粒体融合素基因-2(Mfn2),研究外源性Mfn2基因对MCF-7细胞增殖及对表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)蛋白表达的影响。方法实验分为对照组、转染空质粒pEGFP-N1组、转染Mfn2质粒的pEGFP-Mfn2组。转染48h后,检测各组细胞的转染效率、Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达。检测各组MCF-7细胞增殖情况、各组MCF-7细胞周期分布情况。同时检测各组EGFR及EGF蛋白表达情况。结果转染48h后pEGFP-N1组及pEGFP-Mfn2组转染效率分别为(49.15±2.04)%及(51.10±2.18)%,高于对照组[(0.58±0.21)%,P<0.05];pEGFP-Mfn2组的Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达均显著高于对照组及pEGFP-N1组(P<0.05);pEGFP-Mfn2组MCF-7细胞增殖抑制率显著高于其余两组(P<0.05),细胞周期主要阻滞于G0/G1期;pEGFP-Mfn2组EGFR和EGF蛋白表达水平显著低于其余两组(P<0.05)。结论 Mfn2基因过表达可显著抑制MCF-7细胞增殖,其机制可能与Mfn2基因过表达导致了EGFR及EGF表达下调有关。

Mfn2基因沉默对HepG_2细胞葡萄糖代谢和胰岛素信号通路的影响

目的研究线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)沉默对人肝癌细胞株(HepG2)葡萄糖代谢和胰岛素信号通路分子丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt1)的影响。方法构建Mfn2短发夹双链RNA(Mfn2shRNA)和阴性对照短发夹双链RNA(HK),将HepG2细胞株分为空白对照组(NC)、阴性对照组(HK)、Mfn2shRNA质粒转染组(Mfn2)。HK和Mfn2组细胞应用lipo-fectamine2000转染HepG2细胞株;采用葡萄糖氧化酶的方法和氚标记葡萄糖(3-3H-Glucose)放射性核素示踪法检测细胞葡萄糖消耗量和摄取率;Western blotting检测Mfn2和Akt1蛋白表达。结果与HK组比较,Mfn2组细胞Mfn2蛋白表达明显下降(0.23±0.05 vs 0.51±0.14,P=0.034),Akt1表达差异无统计学意义(0.13±0.00 vs 0.14±0.01,P=0.055);Mfn2组细胞葡萄糖消耗量明显下降(8.72±0.62 vs 9.75±0.35,P=0.001),葡萄糖摄取率亦显著下降(7.94±0.04 vs 9.64±0.13,P=0.002)。结论抑制Mfn2基因表达导致HepG2细胞葡萄糖代谢下降;Mfn2表达对葡萄糖代谢的影响是否通过PI3K/Akt信号通路介导还需要进一步研究。

Mfn2基因抑制Ras-PI3K-Akt信号途径并诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的应用腺病毒介导的转基因技术,研究过表达线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)对WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞(rVSMCs)凋亡的影响并探讨其相关的信号通路。方法体外培养rVSMCs,感染含有Mfn2基因的腺病毒载体(Adv-Mfn2-GFP)。通过免疫组化染色显示细胞凋亡的形态学特征;采用琼脂糖凝胶电泳,Cell DeathELISA观察过表达Mfn2基因对细胞凋亡的影响;用Western blot检测感染Mfn2基因后不同时间点的磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)水平的变化。结果rVSMCs感染Adv-Mfn2-GFP后能有效表达出相应蛋白;过表达Mfn2基因能明显促进rVSMCs凋亡,并抑制ET-1诱导的Akt活化和ERK活化,此作用显示出时间依赖性,且Akt活化受到的抑制更明显。结论过表达Mfn2基因能明显促进WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡,其分子机制是抑制Ras信号途径的活化,分子作用靶点可能是Ras-PI3K-Akt信号通路。

Induced Expression and Optimal Expression Conditions of Recombinant Alpha-bungarotoxin Gene Fusion Protein

[Objective] This study aimed to obtain recombinant alpha-bungarotoxin （a-BG-0 gene fusion protein with biological activity and investiagte its fusion expression. [Method] The plasmid pGEX-a-BGT was transformed into E coil BL21 （DE3） and BL21 （DE3） plysS host bacteria to identify the optimal engineering strain. Fusion expression of the optimal engineering strain was induced, in order to optimize the induced expression conditions of the soluble fusion protein. [Result] JP-a-BGT was identified as the optimal engineering strain, which could express fusion protein after induced by IPTG. The optimal induced expression conditions of the soluble fusion protein were investigatect JP-a-BGT was incubated at 37 ℃ for 2.5 h and induced with 0.50 mmol4. IPTG for 4 h at 22 ℃, and the expression level of the soluble fusion protein reached 18.42%. [Conclusion] This study laid a solid foundation for the subsequent purification of fusion proteins and the separation and purification of a-BGT.

妊娠早期孕妇血清瘦素、β-hCG及融合素α(ADAM12)水平与自然流产发生的相关性研究

目的:探讨妊娠早期妇女血清瘦素、人绒毛膜促性腺激素β(β-hCG)及融合素-α(ADAM12)的浓度变化及这些指标对自然流产发生的预测价值。方法:分别测定172例妊娠妇女(其中自然流产者20例)及非妊娠健康妇女48例,妊娠组在孕10～12周时分别测血清瘦素、β-hCG、ADAM12的浓度。瘦素、β-hCG采用ELISA法测定,ADAM12采用时间分辨荧光免疫分析方法测定,预测界限值根据ROC曲线确定。结果:①在妊娠早期自然流产患者血清β-hCG、瘦素、ADAM12水平低于正常妊娠者,差异显著(P<0.001);自然流产组、正常妊娠组β-hCG、瘦素水平均高于非妊娠组,差异显著(P<0.05)。②妊娠早期以血清瘦素≤11 ng/ml、血清β-hCG≤22 IU/ml及血清ADAM12≤335 ng/ml为预测界值,其预测自然流产发生的曲线下面积、灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)及阴性预测值(NPV)分别为:79.60%、90.00%、71.71%、29.51%和98.20%;91.00%、85.00%、87.50%、47.22%和97.79%;78.40%、80.00%、78.75%、48.48%和94.03%。③根据ROC曲线图确定临界值:以血瘦素≤11 ng/ml、血β-hCG≤22 IU/ml为预测界值,两者联合灵敏度75%,特异度96.05%,阳性预测值71.43%,阴性预测值96.69%,两者联合预测阳性率显著高于单项血清β-hCG及瘦素预测率(P<0.05)。④根据ROC曲线图确定临界值:以血β-hCG≤22 IU/ml、血ADAM12≤335 ng/ml为预测界值,两者联合灵敏度75%、特异度95%,阳性预测值78.95%,阴性预测值93.83%,两者联合预测阳性率显著高于单项血清β-hCG及ADAM12预测率(P<0.05)。结论:妊娠早期,检测孕妇血瘦素、β-hCG及ADAM12,可作为自然流产发生的有效预测指标;联合多项指标可进一步提高对自然流产发生的阳性预测率及准确率。

腺病毒介导的线粒体融合素基因-2诱导大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞凋亡

目的研究腺病毒介导的线粒体融合素基因2(mitofusin2gene,Mfn2)对大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)凋亡的影响。方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,用携带大鼠Mfn2基因(rMfn2)的重组腺病毒Adv rMfn2GFP和含有绿色荧光蛋白基因的对照腺病毒Adv GFP分别感染球囊损伤动脉段,以磷酸缓冲液(PBS)作为未感染对照组,假手术组作为正常对照组,采用免疫组织化学方法检测外源基因表达水平;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞;Image Pro图像分析系统进行血管定量组织形态学分析。结果病毒感染后5d,免疫组织化学证实Adv rMfn2GFP组Mfn2蛋白表达水平明显;TUNEL染色显示,Adv rMfn2GFP组的VSMCs凋亡率明显高于PBS组和Adv GFP组,假手术组未见TUNEL阳性VSMCs(n=10,P<0.01);感染后21d,Adv rMfn2GFP组的血管内膜面积及内膜中膜面积比明显低于对照组(n=10,P<0.01)。结论高表达Mfn2基因可诱导大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞凋亡。

线粒体融合素基因-2对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的研究外源性线粒体融合素基因-2(mfn2)对乳腺癌细胞(MCF-7)凋亡的影响。方法在阳离子聚合物的介导下将含有mfn2 cDNA的质粒在体外转染MCF-7,蛋白印记法(Western blot)检测绿色荧光蛋白(GFP),MTT法检测mfn2对MCi-7细胞增殖的影响。采用Annexin-V/PI双标记法检测转染前后细胞凋亡的变化,JC-1标记细胞线粒体,在流式细胞仪上检测线粒体跨膜电位(△ψm)的变化,电镜观察超微结构的变化。结果转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP蛋白。MTT实验提示,转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,转染mfn2 cDNA后48 h,△ψm下降。与转染pEGFlP组和空白对照组相比,转染pEGFP mfn2组明显促进凋亡,其凋亡率分别为:转染组16.0%,转染空质粒组3.6%,空白对照组4.8%(P<0.05)。电镜观察显示,mfn2使线粒体嵴断裂、消失、基质疏松,肿胀的线粒体围绕在核周呈密集排列。结论mfn2基因在体外转染MCF-7细胞,细胞线粒体膜电位降低,线粒体嵴断裂、消失,细胞凋亡明显增加。

流体力学介导的RNA干扰对小鼠肝脏线粒体融合素基因-2、空腹血糖和血清甘油三酯水平的影响

目的 观察流体力学介导的RNA干扰（RNAi）对小鼠肝脏线粒体融合素基因-2（Mfn2）、空腹血糖（FBS）和血清甘油三酯（TG）水平的影响.方法 将56只雄性BALB/c小鼠随机分为空白对照组（NC组,n=8）、阴性对照组（HK组,n=24）和Mfn2质粒干扰组（Mfn2组,n=24）.HK组小鼠利用流体力学注射75μg阴性对照质粒溶液1.5 ml,Mfn2组小鼠利用流体力学注射75 μg Mfn2 shRNA质粒溶液1.5 ml.应用逆转录-聚合酶链反应和Western blot方法分别测定注射24、72、120 h后,小鼠肝脏Mfn2的mRNA和蛋白质表达;同时分别取血测定小鼠FBS和TG水平.多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Scheffe＇s t检验.结果 质粒注射72、120 h后,Mfn2组小鼠肝组织Mfn2 mRNA相对表达量分别为1.00±0.03和1.01±0.053,较HK组（分别为1.14±0.07和1.18±0.07）明显下降（f值分别为4.027和4.234,P值均＜0.01）; Mfn2蛋白分别为7.81±0.80和8.05±0.15,较HK组（分别为8.01±0.08和8.56±0.01）也明显下降（f值分别为2.941和4.883,P值均＜0.05）.注射24 h后,Mfn2组小鼠FBS低于HK组[（2.65±0.70）mmol/L比（5.28±0.82）mmol/L,t=6.879,P＜0.01],TG高于HK组[（1.96±0.32）mmol/L比（1.12±0.16）mmol/L,t=-6.711,P＜0.01）],HK组与NC组之间FBS和TG差异无统计学意义（F值分别为1.412和2.711,P值均＞0.05）;注射72、12h后,Mfn2组小鼠FBS高于HK组（7.23±0.82）mmol/L比（5.18±0.69）mmol/L,t=2.050,P＜0.01;（7.00±0.67）mmol/L比（6.05±0.76）mmol/L,t=3.57,P＜0.05）],血清TG高于HK组,但差异无统计学意义[（1.53±0.27）mmol/L比（1.37±0.18）mmol/L,t=0.160,P＞0.05;（1.84±0.30）mmol/L比（1.52±0.37）mmol/L,t=0.330,P＞0.05）].结论 流体力学介导的RNAi在干扰72、120h后可有效抑制肝脏目的基因的表达,抑制Mfn2表达可导致小鼠葡萄糖和脂肪代谢异常.

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质控方法和质量标准的建立

目的建立注射用重组葡激酶(staphylokinase,SAK)-水蛭素(hirudin,HV)融合蛋白(SFH)的质控方法和质量标准。方法采用纤维蛋白平板溶圈(fibrin agarose plate assay,FAPA)法测定SFH的溶栓比活性,纤维蛋白凝块溶解法测定SFH的抗凝比活性;还原型SDS-PAGE测定SFH的相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定SFH的纯度;胰酶裂解后采用RP-HPLC法分析SFH的肽图;其他各项指标的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果用建立的方法对SFH原液和成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准能够保证产品安全、有效、质量可控,可用于注射用SFH产品的常规检定。