重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3融合蛋白在大鼠体内的药代动力学研究

研究重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3融合蛋白(GM-CSF/IL-3,MX)在大鼠体内的药代动力学。方法:实验采用同位素示踪技术结合HPLC分析,建立了MX在大鼠血浆中的测定方法,并测定了MX皮下注射3个剂量水平和静脉注射中剂量水平在大鼠体内的药动学参数。结果:高中低剂量T1/2分别为(1 5.4±2.0),(1 6.1±1.8)h,(1 3.2±2.2)h;AUC分别为(5 8 8±1 2 0),(2 8 6±4 7),(1 4 2±2 0)μg/(L.h),Cmax分别为(3 1.2±8.3),(1 4.8±1.2),(8.3±1.4)μg/L。结论:MX皮下注射给药后,Cmax和AUC与剂量成比例,MX在大鼠体内的代谢和消除是线性的。7 0μg/kg组生物利用度为3 5.6%。

重组人干细胞因子/血小板生成素融合蛋白的纯化及复性研究

目的 探讨重组人干细胞因子/血小板生成素(SCF TPO)融合蛋白纯化及复性的最佳方法。方法 裂解 法提取包涵体,在变性条件下利用金属螯和层析获得融合蛋白,经透析及谷胱甘肽氧化还原法对纯化的融合蛋白进 行复性。结果 获得具有初步生物学活性的SCF TPO融合蛋白,其纯度高达90%。结论 该纯化方法操作简捷, 特异性高,纯化效果好,获得率高。

重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对大鼠的致畸作用

目的:观察重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对大鼠胚胎及胎仔的发育毒性和致畸作用。方法:采用雌性SD大鼠,交配成功后随机分为4组,即RCT-18高(129 mg/kg)、中(37 mg/kg)、低(11 mg/kg)剂量组及阴性对照(0.9%NaCl注射液)组,每组≥25只,于妊娠第6～15天连续5次(隔天1次)经皮下注射给药。实验过程中观察动物的一般反应、体质量、摄食量变化,于妊娠第20天解剖孕鼠,对着床、吸收胎、死胎、活胎、黄体进行计数,对胎仔的体质量、身长、尾长,以及外观形态、内脏和骨骼发育等指标进行评价。结果:孕鼠、胚胎形成、胎仔生长发育、外观形态、内脏和骨骼发育等各项指标均无明显异常,与阴性对照组比较无明显毒性影响(P>0.05)。结论:在本试验条件下,RCT-18对SD大鼠未见明显母体毒性和胚胎-胎仔发育毒性,无致畸作用。

成人Xp11.2易位/转录因子E3基因融合相关性肾细胞癌患者临床特征单中心分析

目的探讨成人Xp11.2易位/转录因子E3基因融合相关性肾细胞癌(Xp11.2/TFE3 RCC)的临床表现、影像学表现与治疗效果。方法收集2014年9月至2019年7月海军军医大学(第二军医大学)长海医院收治的经病理确诊的43例成人Xp11.2/TFE3 RCC患者的临床资料,对患者一般情况、临床症状、影像学资料、手术方式、病理资料及预后进行回顾性分析。结果43例Xp11.2/TFE3 RCC患者中男24例、女19例,年龄25~77岁,平均年龄为(47.5±15.2)岁。首发症状为肉眼血尿5例,腰腹部不适6例,转移部位症状表现1例;健康体检时发现、无明显症状者31例。影像学上,病灶最大径1.1~9.5 cm,平均为(5.1±2.7)cm;病灶为类圆形29例,不规则形14例;边界清楚、有假包膜37例,边界不清晰6例;病变多出现密度或信号不均质改变,主要表现为出血(21例)、囊变或坏死(24例)及钙化(11例);中度至明显强化30例,轻度强化13例,其中乳头状强化23例;肾周侵犯10例,远处转移8例。43例患者中15例行腹腔镜根治性肾切除术,13例行腹腔镜肾部分切除术,7例行智能臂辅助腹腔镜肾部分切除术,5例行开放根治性肾切除术,1例行开放肾局部切除术,1例行肾穿刺活检术,1例行转移性椎管肿瘤清除术。43例患者的TFE3免疫组织化学染色检测及3例患者的TFE3荧光原位杂交检测结果均为阳性;免疫组织化学染色检测结果显示碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ;74.4%,32/43)、亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC;93.0%,40/43)、CD10(93.0%,40/43)、希佩尔林道蛋白(VHL;72.1%,31/43)、低分子量细胞角蛋白(CAM5.2;83.7%,36/43)阳性表达率较高,Ki-67阳性率为1%~60%(平均为9.7%)。除6例失访外,其余37例患者术后随访11~68个月,平均(47.4±17.5)个月。随访期间5例患者出现肿瘤全身多发转移,其中3例死亡,2例使用靶向药物治疗后病情无明显进展、患者仍存活;1例患者术后出现复发。结论Xp11.2/TFE3 RCC患者临床表现主要为血尿及腰腹部不适,健康体检时发现及无症状者较多,影像学表现多样,确诊依赖组织病理检测。外科手术尤其根治性肾切除术是Xp11.2/TFE3 RCC患者的首选治疗方法。大部分患者预后良好,少数患者术后出现复发或转移。

人M-CSF与SCF融合蛋白的构建及其在昆虫细胞中的表达

应用重组DNA技术构建M CSF与SCF的融合基因并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体 pVL13 92中 ,通过与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV)DNA共转染草地夜蛾细胞Sf9,融合基因插入AcNPV基因组。重组病毒感染单层Sf9细胞后 ,表达产物分泌到胞外培养液中 ,用MTT比色法和TF 1细胞株可检测到表达产物与IL 3的协同效应。

用于肿瘤靶向治疗的EGF-IL-18融合蛋白在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

目的 :制备能用于肿瘤靶向治疗的重组表皮生长因子受体干扰序列 白细胞介素 18(EGF-IL-18)融合蛋白 ,并鉴定其生物学活性。方法 :利用Bac-to-Bac表达系统在昆虫细胞Sf9中表达融合蛋白 ,用离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等方法纯化表达产物 ,并以IFN-γ诱导实验和EGFR竞争结合实验初步评价融合蛋白的生物活性。结果 :经SDS-PAGE和Westernblot检测 ,Sf9细胞中表达的重组蛋白与预期的EGF-IL-18融合蛋白分子量一致 ,纯化后融合蛋白具有较高纯度和良好的免疫原性。IFN -γ诱导实验和EGFR竞争结合实验显示 ,该融合蛋白具有肿瘤导向性和抗肿瘤活性。结论 :成功表达并纯化了具有肿瘤导向性的抗肿瘤蛋白———EGF-IL-18融合蛋白 ,该蛋白具有较好的肿瘤导向性和抗肿瘤活性 。

表达rhTNFR-Fc的CHO细胞的氨基酸代谢特征及氨基酸流加培养工艺研究

为提高表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)的CHO工程细胞的培养密度和目的蛋白表达,研究了葡萄糖和谷氨酰胺流加-批式培养工艺的细胞氨基酸代谢特征及游离氨基酸和大豆蛋白水解物的补加策略。通过补加葡萄糖和谷氨酰胺浓缩液分别维持其浓度为10 mmol/L和2 mmol/L左右,在不同阶段定期补加特定的氨基酸浓缩液或大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗,检测细胞培养上清中rhTNFR-Fc的表达。谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸等4种非必需氨基酸快速消耗,是CHO工程细胞增殖和目的蛋白表达的限制性底物。以游离氨基酸、游离氨基酸合并大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗可分别使细胞生长密度提高50%、100%,目的蛋白表达增加60%、125%,培养时程延长44%、66%,同时葡萄糖比消耗率、乳酸比生成率降低,谷氨酰胺的利用效率提高。

注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白对大鼠生育力及早期胚胎发育的毒性作用

目的观察注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对大鼠生育力及早期胚胎发育的毒性作用。方法将SD大鼠随机分为4组,分别经皮下注射RCT-18 129、37、11 mg/(kg.d)和0.9%NaCl注射液,每2 d给药1次。雄鼠连续给药5周、雌鼠连续给药2周后,按雌雄1∶1的比例合笼交配,合笼期为2周,计算交配率。雄鼠继续给药至交配成功,雌鼠继续给药至妊娠第6天。实验过程中观察动物的一般反应、体重及摄食量变化。确定雌鼠受精后处死雄鼠,解剖检查睾丸和附睾等生殖器官。于妊娠第15天解剖孕鼠,综合评价妊娠及胚胎形成和早期发育等情况。结果 RCT-18高、中、低剂量组雌性和雄性大鼠均未出现明显的母体毒性反应。各组大鼠各脏器均未见肉眼可见的异常。各剂量RCT-18对大鼠的交配率、妊娠率、生殖系统脏器重量和系数以及早期胚胎发育均无明显影响。结论RCT-18对SD大鼠的生育力及早期胚胎发育无明显毒性作用。

注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白对家兔胚胎及胎仔发育的毒性作用

目的观察注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对家兔胚胎及胎仔发育的毒性作用。方法将受精后的雌兔随机分为RCT-18高、中、低剂量组和阴性对照组,每组15只,于妊娠第6～18天分别经皮下注射RCT-18 51.3、14.7、4.4 mg/(kg.d)和0.9%NaCl注射液,每2 d注射1次,共7次。实验过程中每天观察动物的一般反应、体重及摄食量变化,于妊娠第28天解剖孕兔,对着床、吸收胎、死胎、活胎、黄体进行计数,对胎仔的体重、身长、尾长以及外观形态、内脏和骨骼发育等指标进行考察。结果各组孕兔、胚胎形成、胎仔生长发育、外观形态、内脏和骨骼发育等各项指标均无明显异常,与阴性对照组比较,多数指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RCT-18对妊娠家兔未见明显母体毒性和胚胎-胎仔发育毒性,无致畸作用。

重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白(rhG-CSF-Fc)的质量研究

目的:建立重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准。方法:采用NSF-60细胞增殖法测定生物学活性;非还原SDS-PAGE电泳和RP-HPLC测定纯度;以ELISA法分别测定残留CHO细胞蛋白和蛋白A;其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行。结果:用建立的方法对重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。

抗体-细胞因子融合蛋白治疗肿瘤的前景

细胞因子在免疫系统中发挥重要的调节作用。近年来应用细胞因子治疗肿瘤的临床试验大量展开,但细胞因子体内半衰期短、会产生严重的剂量限制性毒性,这大大限制了其在临床上的应用。随着抗体技术的发展,抗体-细胞因子融合蛋白(也称免疫细胞因子)通过抗体向病变部位靶向递送细胞因子,是一个解决细胞因子临床难题的可选方法。本文以白介素-2(Interleukin-2,IL-2)-免疫细胞因子为例,追踪近期治疗复发/难治/转移性肿瘤的临床试验,综述免疫细胞因子的结构特性,与细胞因子相比的优越性及与其他治疗方式的联用效果,旨在为免疫细胞因子进一步发展提供参考。

注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白在恒河猴体内的安全性

目的评价注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)在恒河猴体内的安全性。方法将恒河猴随机分为4组:低、中、高剂量RCT-18组和对照组,每组8只,低、中、高剂量RCT-18组分别经皮下注射4.6、16.1、57.5 mg/(kg.次)RCT-18,对照组经皮下注射0.7 ml/(kg.次)0.9%氯化钠注射液,每3 d上午同一时间给药1次,共给药91次。每天上午观察记录恒河猴的一般体征,每周常规监测体温1次,并在第1、2、3、13、14、15、28、29和30次给药前、给药后0.5、1、2、4和24 h增加测量动物体温次数。给药0.5、1.5、3、4.5、6、7.5、9个月(停药次日)及停药48 d(恢复期结束),分别对心电图、眼科、血液学、血液生化学、尿常规、血清抗RCT-18抗体、外周血单个核细胞(PBMC)分类计数、血清免疫球蛋白水平(IgG、IgA和IgM)等各项指标进行检查。给药3、6、9个月和恢复期结束,每组各解剖2只猴,进行脏器大体观察,计算脏器系数,并进行组织病理学观察。结果临床反应主要表现为给药后的体温升高;血液学指标出现具有一定剂量-反应关系的单核细胞(monocyte,MONO)数和网织红细胞(reticulocyte,RETIC)升高或网织红细胞平均体积(mean reticulocyte volume,MCVr)降低;3个剂量RCT-18组恒河猴的脏器重量和脏器系数与同期对照组相比,均无明显变化,且未见明显的脏器大体病变;3个剂量RCT-18组均出现无明显剂量相关但可逆的脾小结和淋巴滤泡萎缩;在整个试验期内未检测出血清中的抗RCT-18抗体;3个剂量组外周血淋巴细胞中IgD+细胞(成熟B淋巴细胞)比率均略有下降,但与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);血清IgG、IgA和IgM从给药0.5～1.5个月后开始明显下降,恢复期结束时,除了中剂量的IgA水平,其他3个剂量RCT-18组的IgG、IgA和IgM水平均出现不同程度的回升。结论 RCT-18对恒河猴具有明显的但可恢复的免疫抑制作用。

重组人IL-6D24-PE40外毒素融合蛋白的构建及其生物学效应

目的 构建重组人白细胞介素 6 绿脓杆菌外毒素融合蛋白IL 6D2 4 PE40 ,以选择性杀伤高表达IL 6受体 (IL 6R)的肿瘤细胞和白血病细胞。方法 采用重叠延伸的基因融合技术将N 末端缺失 2 4个氨基酸的重组人白细胞介素 6 (IL 6D2 4)cDNA与缺失细胞结合区的绿脓杆菌外毒素PE40基因进行融合 ,构建IL 6D2 4 PE40融合基因。利用HB10 1/pBV2 2 0表达系统 ,实现了IL 6D2 4 PE40融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,经MonoQ柱进行层析纯化 ,采用MTS法检测细胞毒活性。结果 IL 6D2 4 PE40融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到 40 %～ 6 0 %。包涵体蛋白经分离、复性及纯化得到纯度 >95 %的融合蛋白。Westernblot证明 ,纯化的融合蛋白与IL 6抗体及PEA抗体均发生特异性结合。细胞毒活性检测证实 ,IL 6D2 4 PE40融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL 6R的U937细胞 ,ID50 约为 2 5 0ng/ml,而对不表达IL 6R的CEM细胞无杀伤作用。结论 IL 6D2 4 PE40融合蛋白能够选择性杀伤高表达IL 6R的靶细胞 ,有希望成为导向治疗高表达IL 6 /IL