双靶点抗乳腺癌融合蛋白Del1-9-G129R-endostatin真核表达载体的设计构建

目的:构建双靶点抗乳腺癌融合蛋白Del1-9-G129R-endostatin的真核表达载体。方法:以质粒pET22b(+)Del1-9-G129R-hPRL为模板,PCR扩增首尾端带有HindⅢ和BamHI识别序列的目的基因Del1-9-G129R-hPRL,用于融合基因合成,同时扩增首尾端带有HindⅢ和KpnI的单基因作为对照。提取人肝脏总RNA,利用RT-PCR技术扩增两端带有BamHI、KpnI以及HindⅢ、KpnI识别序列的目的DNA片段Endostatin,分别用于融合基因合成和单基因对照。采用重叠延伸PCR技术,将以上二单基因作为模板,扩增首尾端带有HindⅢ和KpnI识别序列的融合蛋白Del1-9-G129R-endostatin基因片段。目的基因插入T载体测序正确后,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。结果:DNA测序结果显示融合蛋白cDNA序列与GenBank中完全一致。结论:成功构建融合蛋白真核表达载体pEGFP-N1-Del1-9-G129R-endostatin,为下一步在体外细胞水平研究融合蛋白生物学活性做好准备。

双靶点抗乳腺癌Del1-9-G129R-T3融合蛋白真核表达载体的构建及体外抗肿瘤活性实验

目的:构建融合蛋白Del1-9-G129R-T3真核表达载体,研究融合蛋白相对于人催乳素受体拮抗剂Del1-9-G129R和肿瘤抑素(tumstatin)活性多肽T3对乳腺癌细胞MDA-MB-231和人脐静脉内皮细胞HUVEC抑制增殖与促进凋亡作用的差异。方法:以质粒pET22b(+)Del1-9-G129R-T3为模板,PCR扩增目的片段Del1-9-G129R-T3和Del1-9-G129R,链接至pCDNA3.1(-)/Myc-His A真核表达载体。T3片段由上海生工合成并以直接退火的方式链接载体。qRT-PCR和Western Blot分别检测目的基因在mRNA和蛋白水平的相对表达。CCK8细胞增殖实验和流式细胞术分别测定MDA-MB-231和HUVEC细胞的增殖与凋亡。结果:重组质粒转染MDA-MB-231和HUVEC细胞后,qRT-PCR和Western Blot检测目的基因在细胞内有较高的相对表达。CCK8和流式分析显示,融合蛋白Del1-9-G129R-T3对MDA-MB-231细胞抑制增殖和促进凋亡作用比对照Del1-9-G129R和T3肽效果更显著,而且对MDA-MB-231细胞作用明显高于HUVEC细胞。结论:Del1-9-G129R-T3相比Del1-9-G129R和T3,对乳腺癌细胞的抑制增殖和促进凋亡效果更佳。MDA-MB-231细胞相比HUVEC细胞,融合蛋白作用更明显。

一种新型双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白原核表达质粒的构建

目的:利用基因重组技术,构建Del1-9-G129R-T3双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白的原核表达质粒。方法:以质粒pET22b-G129R-G129R为模板,PCR扩增两端带有NdeI和BamHI识别序列的目的基因Del1-9-G129R-hPRL。根据T3的碱基序列,采用重叠延伸PCR技术人工设计合成三段引物,扩增两端带有BamHI和XhoI识别序列的T3目的基因片段。将纯化的Del1-9-G129R-hPRL、T3作为模板,利用前者的上游引物和后者的下游引物,PCR扩增带有NdeI和XhoI识别序列的融合基因Del1-9-G129R-T3,克隆到T载体,双酶切后插入pET22b(+)多克隆位点,构建原核表达载体pET22b-Del1-9-G129R-T3。经DNA测序正确后,将重组表达质粒转化原核表达菌BL21(DE3)。结果:质粒测序显示重组融合蛋白基因序列除两处同义突变外与GenBank中记载的碱基序列完全一致。结论:成功构建了融合蛋白Del1-9-G129R-T3基因原核表达质粒。